VECTORES BASADOS EN EL VIRUS DE LA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA (VAIE).

Genoma de vector de VAIE que puede estar empaquetado y que puede expresar genes heterólogos,

caracterizado porque comprende un gen gag truncado pero que conserva una señal de empaquetamiento de gag, en el que: (i) el truncamiento de gag elimina más de un nucleótido en el sentido de 3' del nucleótido 350 de la secuencia codificante de gag; y (ii) la señal de empaquetamiento comprende los nucleótidos 1-109 de la secuencia codificante de gag

Vectores basados en el virus de la anemia infecciosa equina (VAIE) .

La presente invención se refiere a un genoma de vector de VAIE. En particular, pero no exclusivamente, se refiere a genomas de vector de VAIE que pueden estar empaquetados y por tanto que pueden transferir material genético a células que no se dividen o se dividen lentamente.

Ha habido un considerable interés, durante algún tiempo, en el desarrollo de sistemas de vectores retrovirales basados en lentivirus, un pequeño subgrupo de los retrovirus. Este interés surge en primer lugar a partir de la idea de utilizar vectores basados en VIH para dirigir genes terapéuticos anti-VIH a células susceptibles al VIH susceptible células y en segundo lugar a partir de la predicción de que, dado que los lentivirus pueden infectar células que no se dividen (Lewis & Emerman 1993 J. Virol. 68, 510) , los sistemas de vector basados en estos virus podrían transducir células que no se dividen (por ejemplo Vile & Russel 1995 Brit. Med. Bull. 51, 12) . Se han producido sistemas de vector basado en VIH (Buchschacher & Panganiban 1992 J.Virol. 66, 2731) y se han utilizado para transducir células CD4+ y, tal como se anticipaba, células que no se dividen (Naldini et al, 1996 Science 272, 263) . Además, los vectores lentivirales permiten la expresión a largo plazo muy estable del gen de interés. Ésta ha mostrado ser de por lo menos tres meses para células neuronales de rata transducidas. Los vectores basados en VLM sólo podían expresar el gen de interés durante seis meses.

Los vectores basados en VIH producidos hasta la fecha dan como resultado un provirus integrado en la célula transducida que presenta LTR de VIH en sus extremos. Esto limita la utilización de estos vectores ya que las LTR han de utilizarse como señales de expresión para cualquier gen insertado a menos que se utilice un promotor interno. La utilización de promotores internos presenta importantes desventajas. El resultado impredecible de colocar promotores adicionales dentro de la unidad de transcripción de LTR retroviral está bien documentado (Bowtell et al, 1988 J.Virol. 62, 2464; Correll et al, 1994 Blood 84, 1812; Emerman y Temin 1984 Cell 39, 459; Ghattas et al, 1991 Mol.Cell.Biol. 11, 5848; Hantzopoulos et al, 1989 PNAS 86, 3519; Hatzoglou et al, 1991 J. Biol. Chem 266, 8416; Hatzoglou et al, 1988 J.Biol.Chem 263, 17798; Li et al, 1992 Hum. Gen. Ther. 3, 381; McLachlin et al, 1993 Virol. 195, 1; Overell et al, 1988 Mol. Cell Biol. 8, 1803; Scharfman et al, 1991 PNAS 88, 4626; Vile et al, 1994 Gen Ther 1, 307; Xu et al, 1989 Virol. 171, 331; Yee et al, 1987 PNAS 84, 5197) . Los factores implicados parecen incluir la posición y orientación relativa de los dos promotores, la naturaleza de los promotores y los genes expresados y cualquier procedimiento de selección que pueda adoptarse. La presencia de promotores internos puede afectar tanto a los títulos de transducción que pueden obtenerse a partir de una línea celular de empaquetamiento y la estabilidad del vector integrado.

Las LTR de VIH y otros lentivirus presentan requisitos específicos de virus para la expresión génica. Por ejemplo, la LTR de VIH no es activa en ausencia de la proteína Tat viral (Cullen 1995 AIDS 9, S19) . Es deseable, por tanto, modificar las LTR de tal manera que cambien los requisitos para la expresión génica. En particular, pueden requerirse señales de expresión génica específicas de tejido para algunas aplicaciones de terapia génica.

Los vectores de VIH vectores presentan varias desventajas importantes que pueden limitar su aplicación terapéutica para determinadas enfermedades. El VIH-1 presenta la desventaja de ser un patógeno humano que lleva proteínas y secuencias potencialmente oncogénicas. Existe el riesgo de que la introducción de partículas de vector producidas en el empaquetamiento de células que expresan gag-pol de VIH introduzca estas proteínas en el paciente conduciendo a seroconversion. Por estos motivos, existe una necesidad de desarrollar vectores basados en lentivirus que no introduzcan proteínas de VIH en los pacientes.

Se ha descubierto que es posible proporcionar un vector lentiviral mejorado que supera las limitaciones de vectores basados en VIH. Es importante en el desarrollo de cualquier sistema de vector retroviral para eliminar secuencias del genoma retroviral que pueden inhibir la capacidad del vector para transferir genes heterólogos o que pueden transferir secuencias codificantes de proteínas desfavorables para la célula diana. Los retrovirus están limitados en la longitud de secuencias de ARN que pueden empaquetarse eficazmente y de modo que la existencia de largas regiones del genoma retroviral limita gravemente la capacidad de codificación del vector para ARN codificante heterólogo.

También se ha descubierto que es posible proporcionar un vector lentiviral basado en un lentivirus que no es de primate que presenta una alta capacidad de codificación para secuencias codificantes heterólogas y que presenta una capacidad reducida para transferir componentes retrovirales a la célula diana.

Se ha descubierto sorprendentemente que la cantidad de secuencia genómica de vector requerida de un lentivirus que no es de primate para producir un vector de clonación eficaz es sustancialmente menor de lo que se ha descrito para un vector basado en VIH.

Los requisitos de secuencia para empaquetar genomas de vector de VIH son complejos. La señal de empaquetamiento de VIH engloba el sitio donador de corte y empalme y contiene una parte de la región no traducida en 5' del gen gag que presenta una supuesta estructura secundaria que contiene 4 horquillas cortas. Es conocido

asimismo que secuencias adicionales en cualquier lugar en el genoma son importantes para la encapsidación eficaz del VIH. Por ejemplo las primeras 350 pb de la secuencia codificante de la proteína gag pueden contribuir al empaquetamiento eficaz y también están implicadas regiones mal definidas de env. Para la construcción de vectores de VIH que pueden expresar genes heterólogos, se ha utilizado una señal de empaquetamiento que se extiende hasta por 350 pb de la región codificante de la proteína gag.

Se ha descubierto sorprendentemente que la estructura de la señal de empaquetamiento en lentivirus que no es de primate es completamente diferente de la de VIH. En lugar de una corta secuencia de 4 horquillas seguida por una región mal definida de secuencias de gag y env, se ha descubierto que una región más corta del gen gag basta para un empaquetamiento eficaz. De hecho la deleción de mayores regiones del gen gag en vectores de VAIE es ventajosa y conduce a que se produzca un vector de mayor título viral. Esta información puede utilizarse para proporcionar vectores mejorados construidos a partir de secuencias de lentivirus que no son de primate que presentan un alto título y características ventajosas en comparación con los vectores de VIH.

Según un aspecto de la presente invención, está previsto un genoma de vector de VAIE que puede estar empaquetado y que puede expresar genes heterólogos, caracterizado porque comprende un gen gag truncado pero que conserva una señal de empaquetamiento de gag, en el que:

(i) el truncamiento de gag elimina más de un nucleótido en el sentido de 3' del nucleótido 350 de la secuencia codificante de gag; y

(ii) la señal de empaquetamiento comprende los nucleótidos 1-109 de la secuencia codificante de gag.

Por tanto, está previsto un genoma de vector de VAIE que contiene un gen gag delecionado de un VAIE en el que la deleción en gag elimina uno o más nucleótidos en el sentido de 3' del nucleótido 350 de la secuencia codificante de gag. Preferentemente la deleción se extiende desde el nucleótido 350 hasta por lo menos el extremo C-terminal de la región codificante de gagpol. Más preferentemente la deleción adicionalmente elimina el nucleótido 300 de la región codificante de gag y lo más preferentemente la deleción conserva sólo los primeros 150 nucleótidos de la región codificante de gag. Sin embargo también pueden utilizarse deleciones de gag incluso mayores, por ejemplo la región codificante de gag contiene los primeros 109 nucleótidos de la región codificante de gag. También puede ser posible que la región codificante de gag contenga sólo los primeros 2 nucleótidos de la región codificante de gag.

Están incluidas características adicionales del genoma de VAIE en el genoma de vector que son necesarias para la transducción de la célula diana; replicación; transcripción inversa e integración.... [Seguir leyendo]

1. Genoma de vector de VAIE que puede estar empaquetado y que puede expresar genes heterólogos, caracterizado porque comprende un gen gag truncado pero que conserva una señal de empaquetamiento de gag, 5 en el que:

(i) el truncamiento de gag elimina más de un nucleótido en el sentido de 3' del nucleótido 350 de la secuencia codificante de gag; y (ii) la señal de empaquetamiento comprende los nucleótidos 1-109 de la secuencia codificante de gag.

2. Genoma de vector de VAIE según la reivindicación 1, en el que la señal de empaquetamiento comprende los nucleótidos 1-150 de la secuencia codificante de gag.

3. Genoma de vector de VAIE según la reivindicación 1, en el que la señal de empaquetamiento comprende los nucleótidos 1-299 de la secuencia codificante de gag.

4. Genoma de vector de VAIE según la reivindicación 1, en el que la señal de empaquetamiento comprende los nucleótidos 1-349 de la secuencia codificante de gag. 20

5. Genoma de vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el truncamiento deleciona todos los nucleótidos desde el nucleótido 350 de la región codificante de gag hasta por lo menos el extremo C-terminal de la región codificante de gag-pol.

6. Genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el genoma de VAIE carece del gen tat pero incluye las secuencias líder entre el extremo de la LTR en 5' y el ATG de gag.

7. Sistema de producción de VAIE que comprende una célula de empaquetamiento que comprende el genoma de vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, un gen gag-pol de VAIE y un gen de envuelta. 30

8. Sistema de producción según la reivindicación 7, en el que están ausentes uno o más genes auxiliares.

9. Sistema de producción según la reivindicación 7, en el que están ausentes uno o más genes seleccionados de entre dUTPasa, S2, env y tat.

10.Sistema de producción según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que está ausente RRE/Rev del sistema.

11.Sistema de producción según la reivindicación 10, en el que RRE/Rev se sustituye por un sistema de exportación 40 de ARN heterólogo.

12.Sistema de producción según la reivindicación 10, en el que el gen gag-pol está optimizado para los codones.

13.Partícula de VAIE producida por el sistema de producción según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

45 14.Sistema de vector viral que comprende un vector poxviral y un genoma de vector viral de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

15.Partícula viral que puede obtenerse a partir del sistema de vector viral según la reivindicación 14.

50 16.Célula transfectada o transducida con un genoma de vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una partícula según la reivindicación 13 ó 15.

17.Genoma de vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, partícula según la reivindicación 13 ó 55 15, o célula según la reivindicación 16, para su utilización en medicina.

18.Utilización de un genoma de vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, partícula según la reivindicación 13 ó 15, o célula según la reivindicación 16 para la preparación de una composición farmacéutica para suministrar un nucleótido de interés a un sitio diana que lo necesita.

60 19.Utilización según la reivindicación 18, en el que el nucleótido de interés codifica, o incluye, una proteína supresora tumoral, una enzima tal como una enzima activadora de profármacos, una molécula inmunomoduladora, un anticuerpo, una molécula similar a inmunoglobulina diseñada mediante ingeniería genética, una proteína de fusión, una hormona, una proteína de membrana, una proteína o péptido vasoactivo, una citocina, una quimiocina, 65 una proteína antiviral, un ARN antisentido o una ribozima.

20.Procedimiento para producir la célula según la reivindicación 15, que comprende transfectar o transducir una célula con un genoma de vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una partícula según la reivindicación 13 ó 15.