Construcciones de antígenos útiles en la detección y diferenciación de anticuerpos contra el VIH.

Una construcción de antígeno que consiste en una secuencia de aminoácidos de ID SEC NO:

55 o en una secuencia de aminoácidos diferente de la secuencia de aminoácidos de ID SEC NO: 55 por un cambio conservativo debido a sustituciones de 1 a 5 aminoácidos, en la que la construcción de antígeno no reacciona en cruzado con anticuerpos contra el VIH-1

Construcciones de antígenos útiles en la detección y diferenciación de anticuerpos contra el VIH

Antecedentes de la invención La presente descripción se refiere de forma general a inmunoensayos para la detección y diferenciación de anticuerpos contra el Virus de la Inmunodeficiencia Humana de tipo 1 (VIH-1) del Grupo M, contra el VIH-1 del Grupo O y contra el Virus de la Inmunodeficiencia Humana de tipo 2 (VIH-2) . Más particularmente, la descripción se refiere a nuevas construcciones de antígenos útiles como reactivos en dichos ensayos, así como a polinucleótidos, clones de ADN, vectores de expresión, células hospedadoras transformadas y similares que son útiles en la preparación de dichos antígenos.

La detección de una infección por VIH en un paciente, y la caracterización del tipo vírico, se realizan típicamente usando inmunoensayos basados en la interacción altamente específica entre los antígenos usados como reactivos en el ensayo y los anticuerpos circulantes en el suero del paciente. La inmunorreactividad de los anticuerpos del paciente con algunos antígenos, y a un menor grado o de ninguna manera con otros, permite la identificación del tipo y subtipo del VIH que está presente.

Actualmente existen dos grupos filogenéticos principales del VIH-1 denominados Grupos "M" y "O." G. Meyers y col., Human Retroviruses and AIDS 1995, Los Alamos National Laborator y , Los Ã?lamos, NM (1995) . Los aislados del VIH-1 del Grupo M se han dividido adicionalmente en subgrupos (A J) que desde el punto de vista filogenético están aproximadamente equidistantes entre sí. Los aislados del Grupo M predominan en todo el mundo. Los informes más recientes sobre la secuencia del VIH-1 del Grupo O indican que estos virus estaban tan estrechamente relacionados con un virus de chimpancé como con otros subgrupos del VIH-1. Véase, por ejemplo, L. G. Gürtler y col., J. Virology 68; 1581 -1585 (1994) ; M. Vanden Haesevelde y col., J. Virology 68: 1586 -1596 (1994) ; De Leys y col., J. Virology

64: 1207 -1216 (1990) ; DeLeys y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.304.466; L. G. Gürtler y col., Publicación de Patente Europea N 591914 A2. Las secuencias del Grupo O son las más divergentes de las secuencias del VIH-1 descritas hasta la fecha. Aunque las cepas del VIH-1 del Grupo O son endémicas del Ã?frica central occidental (Camerún, Guinea Ecuatorial, Nigeria y Gabón) , ahora se han identificado pacientes infectados con aislados del Grupo O en Bélgica, Francia, Alemania, España y Estados Unidos. Véase, por ejemplo, R. DeLeys y col., citado anteriormente; P. Chamneau y col., Virology 205: 247 -253 (1994) ; I. Loussert-Ajaka y col., J. Virology 69: 5640 5649 (1995) ; H. Hampl y col., Infection 23: 369 -370 (1995) ; A. Mas y col., AIDS Res. Hum. Retroviruses 12: 1647 1649 (1996) ; M. Peters y col., AIDS 11: 493 -498 (1997) ; y M. A. Rayfield y col., Emerging Infectious Diseases 2: 209 -212 (1996) .

La serología del VIH-1 del Grupo M se caracteriza en su mayor parte por las secuencias de aminoácidos de las proteínas víricas expresadas (antígenos) , particularmente aquellas que comprenden las regiones del núcleo y de la cubierta (env) . Como entre diversas cepas de este virus de rápida mutación, estos antígenos son estructural y funcionalmente similares, pero tienen secuencias de aminoácidos divergentes que desencadenan anticuerpos que son similares pero no idénticos en su especificidad por un antígeno en particular.

Uno de los objetivos serológicos clave para la detección de una infección por VIH-1 es la proteína transmembrana de 41.000 PM (TMP) , la glucoproteína 41 (gp41) . La gp41 es una proteína altamente inmunógena que desencadena una respuesta de anticuerpos fuerte y sostenida en individuos considerados seropositivos para el VIH. Los anticuerpos contra esta proteína son de los primeros en aparecer en la seroconversión. Aparentemente la respuesta inmunitaria contra la gp41 permanece relativamente fuerte durante la enfermedad, según manifiesta la prácticamente universal presencia de anticuerpos anti-gp41 en pacientes asintomáticos, así como en aquellos que muestran las etapas clínicas del SIDA. Una proporción significativa de la respuesta de los anticuerpos frente a la gp41 está dirigida hacia una región inmunodominante (IDR) bien caracterizada de la gp41.

Las infecciones por el VIH de tipo 2 (VIH-2) , un virus encontrado inicialmente en individuos procedentes de Ã?frica, se han identificado ahora en seres humanos fuera del área endémica inicial del Ã?frica occidental y se ha informado en personas europeas que han vivido en Ã?frica occidental o que han tenido relaciones sexuales con individuos procedentes de esta región. Véase, por ejemplo, A. G. Saimot y col. Lancet i: 688 (1987) ; M. A. Rey y col. Lancet i: 388 -389 (1987) ; A. Werner y col. Lancet i: 868 -869 (1987) ; G. Brucker y col. Lancet i: 223 (1987) ; K. Marquart y col., AIDS 2: 141 (1988) ; CDC, MMWR 37: 33 -35 (1987) ; Anónimo, Nature 332: 295 (1988) . En todo el mundo se han documentado casos de SIDA debidos al VIH-2. Los estudios serológicos indican que mientras que los VIH-1 y los VIH-2 comparten múltiples epítopos comunes en sus antígenos del núcleo, las glucoproteínas de la cubierta de estos dos virus tienen una reactividad cruzada mucho menor. F. Clavel, AIDS 1: 135 -140 (1987) . Se cree que esta reactividad cruzada limitada de los antígenos de la cubierta explica por qué los ensayos serológicos disponibles actualmente para el VIH-1 pueden fracasar al reaccionar con ciertos sueros de individuos con anticuerpos contra el VIH-2. F. Denis y col., J. Clin. Micro. 26: 1000 -1004 (1988) . La recientemente concedida Patente de Estados Unidos Nº 5.055.391 cartografía el genoma del VIH-2 y proporciona ensayos para detectar el virus.

El documento WO 91/07664 describe construcciones del VIH-2 que comprenden la parte caxboxi terminal de la

gp120 y la parte amino-terminal de la gp120 para aplicaciones de diagnóstico. El documento WO 95/23973 describe construcciones de antígenos para la detección de anticuerpos contra el VIH-2.

En la mayoría de los casos, estas cepas víricas se identifican y se caracterizan fácilmente usando pruebas diagnósticas disponibles en el comercio. Sin embargo, han surgido preocupaciones relativas a la capacidad de los inmunoensayos disponibles actualmente, diseñados para la detección de anticuerpos contra el VIH-1 (Grupo M) y/o contra el VIH-2, para detectar la presencia de anticuerpos contra el VIH-1 del Grupo O. I. Loussert-Ajaka y col. Lancet 343: 1393 -1394 (1994) ; C. A. Schable y col. Lancet 344: 1333 -1334 (1994) ; L. Gürtler y col., J. Virol. Methods 51: 177 -184 (1995) . Aunque hasta la fecha se han encontrado pocos pacientes fuera del Ã?frica central occidental infectados con aislados del VIH-1 del Grupo O, las autoridades sanitarias temen la aparición de este subtipo también en otras áreas geográficas.

Consecuentemente, existe una continua necesidad de nuevos antígenos, adecuados para su uso en inmunoensayos, que solos o conjuntamente con otros antígenos permitan el reconocimiento de todos los aislados y/o infecciones por el VIH-1 (del Grupo M y del Grupo O) y por el VIH-2.

Resumen de la invención La presente invención proporciona una construcción de antígeno que consiste en una secuencia de aminoácidos de ID SEC NO: 55 o en una secuencia de aminoácidos diferente de la secuencia de aminoácidos de ID SEC NO 55 por un cambio conservativo debido a sustituciones de 1 a 5 aminoácidos, en la que la construcción de antígeno no reacciona en cruzado con los anticuerpos contra el VIH-1.

La presente invención proporciona además un polinucleótido que codifica una construcción de antígeno como se define anteriormente.

La presente invención proporciona incluso además un procedimiento para detectar anticuerpos contra el VIH-2 en una muestra de ensayo que comprende las etapas de:

(a) combinar al menos una construcción de antígeno como se define anteriormente con la muestra de ensayo para formar una mezcla;

(b) incubar la mezcla en condiciones adecuadas para la formación de complejos entre el antígeno y los anticuerpos, si hubiera, que están presentes en la muestra y que son inmunológicamente reactivos con el antígeno; y

(c) detectar la presencia de cualquier complejo formado.

Adicionalmente, la presente invención proporciona un kit de inmunoensayo para la detección de anticuerpos contra el VIH-2 que comprende una construcción de antígeno como se define anteriormente.

Para comparar, la presente descripción también incluye otras construcciones de antígenos, polinucleótidos, inmunoensayos y kits que no se incluyen en la invención como se define anteriormente.

1. Una construcción de antígeno que consiste en una secuencia de aminoácidos de ID SEC NO: 55 o en una secuencia de aminoácidos diferente de la secuencia de aminoácidos de ID SEC NO: 55 por un cambio conservativo debido a sustituciones de 1 a 5 aminoácidos, en la que la construcción de antígeno no reacciona en cruzado con anticuerpos contra el VIH-1

2. Un polinucleótido que codifica una construcción de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Un procedimiento para detectar anticuerpos contra el VIH-2 en una muestra de ensayo que comprende las etapas de:

(a) combinar al menos una construcción de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 con la muestra de ensayo para formar una mezcla;

(b) incubar la mezcla en condiciones adecuadas para la formación de complejos entre el antígeno y los anticuerpos, si hubiere, que están presentes en la muestra y que son inmunológicamente reactivos con el antígeno; y

(c) detectar la presencia de cualquier complejo formado.

4. Un kit de inmunoensayo para la detección de anticuerpos contra el VIH-2 que comprende una construcción de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1.