Genoma de vector lentivírico que comprende tres o más secuencias de nucleótidos de interés ligadas funcionalmente por dos o más sitios internos de entrada ribosómica,

en el que las secuencias de nucleótidos de interés codifican una proteína seleccionada de entre el grupo siguiente: tirosina hidroxilasa, GTP-ciclohidrolasa I, aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa y transportador vesicular de monoaminas de tipo

Vectores lentivíricos para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas.

La presente invención se refiere a un sistema de vector. En particular, la presente invención se refiere a un sistema de vector lentivírico destinado al tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Antecedentes

Enfermedad de Parkinson

La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la pérdida de la ruta nigroestriatal. Aunque la causa de la enfermedad de Parkinson es desconocida, se asocia a la muerte progresiva de las neuronas mesencefálicas dopaminérgicas (positivas para tirosina hidroxilasa (TH)), induciendo alteraciones motoras. Los síntomas característicos de la enfermedad de Parkinson aparecen tras la degeneración de por lo menos 70% de las neuronas nigroestriatales TH-positivas.

En la actualidad no existe una cura satisfactoria para la enfermedad de Parkinson. El tratamiento sintomático de las alteraciones motoras asociadas a la enfermedad implica la administración oral de dihidroxifenilalanina (L-DOPA). La L-DOPA resulta transportada a través de la barrera hematocefálica y se convierte en dopamina, parcialmente por parte de neuronas dopaminérgicas residuales, conduciendo a una mejora sustancial de la función motora. Sin embargo, tras unos cuantos años, progresa la degeneración de las neuronas dopaminérgicas, se reducen los efectos de la L-DOPA y reaparecen los efectos secundarios. Por lo tanto, resulta necesaria una terapia mejor para la enfermedad de Parkinson.

Una estrategia alternativa para la terapia es el injerto neural, que se basa en la idea de que la dopamina suministrada por las células implantadas en el cuerpo estriado puede sustituir la pérdida de células nigroestriatales. Los ensayos clínicos han demostrado que las neuronas mesencefálicas TH-positivas obtenidas de cadáveres de embrión humano (fetos abortados) pueden sobrevivir y funcionar en los cerebros de pacientes con la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, la recuperación funcional sólo ha sido parcial, y la eficacia y reproducibilidad del procedimiento son limitadas. Además, existen cuestiones éticas, prácticas y de seguridad asociadas a la utilización de tejidos derivados de fetos humanos abortados. Además, las grandes cantidades de tejido necesarias para producir un efecto terapéutico probablemente demostrarán ser prohibitivas. Se han realizado algunos intentos para utilizar neuronas TH-positivas de otras especies (con el fin de evitar algunos de los problemas éticos y prácticos). Sin embargo, el xenotrasplante requiere el tratamiento inmunosupresor y también resulta controvertido debido a, por ejemplo, el posible riesgo de transferencia entre especies de agentes infecciosos. Otra desventaja es que, en los protocolos actuales de injertación, no sobreviven más de 5% a 20% del número esperado de neuronas TH-positivas injertadas. Con el fin de desarrollar un protocolo de trasplante practicable y eficaz, resulta necesaria una fuente alternativa de neuronas TH-positivas.

Una estrategia adicional para la terapia es la terapia génica. Se ha sugerido que la terapia génica podría utilizarse en la enfermedad de Parkinson de dos maneras: sustituyendo la dopamina en el cuerpo estriado afectado, mediante la introducción de los enzimas responsables de la síntesis de L-DOPA o de dopamina (por ejemplo tirosina hidroxilasa), e introduciendo moléculas neuroprotectoras potenciales que podrían evitar la muerte de las neuronas TH-positivas o estimular la regeneración y recuperación funcional en el sistema nigroestriatal dañado (Dunnet S.B. y Björklund A., Nature 399:A32-A39, 1999).

In vivo, la dopamina es sintetizada a partir de la tirosina por dos enzimas: la tirosina hidroxilasa (TH) y la aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa (AADC). Se ha demostrado que la enfermedad de Parkinson responde al tratamiento que facilita la transmisión dopaminérgica en el núcleo caudado-putamen. En animales experimentales, las células modificadas genéticamente que expresan tirosina hidroxilasa y que de esta manera sintetizan L-DOPA, inducen la recuperación comportamental en modelos de roedor de PD (Wolff et al., PNAS (USA) 86:9011-14, 1989; Freed et al., Arch. Neurol. 47:505-12, 1990; Jiao et al., Nature 262:4505, 1993).

La actividad funcional de la tirosina hidroxilasa depende de la disponibilidad de su cofactor tetrahidrobiopterina (BH₄). El nivel de cofactor puede resultar insuficiente en el cuerpo estriado denervado, y por lo tanto se cree que también podría resultar necesaria la transducción de la GTP ciclohidrolasa I, el enzima que cataliza la etapa limitante de la velocidad en la ruta de síntesis de BH₄, para obtener niveles suficientes de producción de L-DOPA in vivo (Bencsics et al., J. Neurosci. 16:4449-4456, 1996; Leff et al., Exp. Neurol. 151:249-264, 1998).

Aunque ya se han propuesto estrategias de terapia génica in vivo y ex vivo para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (Dunnet y Björklund, supra, 1999; Raymon et al., Exp. Neurol. 144:82-91, 1997; Kang, Mov. Dis. 13:59-72, 1998), la limitada eficiencia de la transferencia génica y de la expresión en las células diana ha dificultado un avance significativo de esta tecnología. Un problema a este respecto es que las células diana habitualmente son células que no se dividen (es decir, neuronas), que son notoriamente recalcitrantes a la transducción.

Expresión de más de una proteína

El documento WO nº 98/18934 se refiere a una secuencia polinucléotida para la utilización en la terapia génica, comprendiendo dicha secuencia polinucléotida dos o más genes terapéuticos ligados funcionalmente a un promotor, y que codifica un producto de proteína de fusión de los genes terapéuticos. Lo expuesto anteriormente proporciona un modo de expresar dos genes terapéuticos a partir de un único "gen quimérico". En una forma de realización preferida, la secuencia polinucleótida es capaz de codificar una proteína de fusión que comprende tirosina hidroxilasa y DOPA descarboxilasa en el orden TH-DD o DD-TH, unidos mediante una molécula conectora flexible.

Tal como se ha expuesto en el documento WO nº 98/18924, entre los sistemas de transferencia génica, los vectores retrovíricos resultan sustancialmente prometedores para la terapia génica. Estos sistemas pueden transferir genes eficientemente y están emergiendo nuevos vectores que resultan particularmente útiles para la transferencia génica a células cerebrales (Naldini et al., Science 272:263, 1996). Sin embargo, resulta evidente a partir de la literatura que los vectores retrovíricos consiguen los títulos más altos y las propiedades de expresión génica más potentes en el caso de que se mantengan en un estado genéticamente simple (patente PCT nº GB96/01230; Bowtell et al., J. Virol. 62:2464, 1988; Correll et al., Blood 84:1812, 1994; Emerman y Temin, Cell 39:459, 1984; Ghattas et al., Mol. Cell. Biol. 11:5848, 1991; Hantzopoulos et al., PNAS 86:3519, 1989; Hatzoglou et al., J. Biol. Chem. 266:8416, 1991; Hatzoglou et al., J. Biol. Chem. 263:17798, 1988; Li et al., Hum. Gen. Ther. 3:381, 1992; McLachlin et al., Virol. 195:1, 1993; Overell et al., Mol. Cell. Biol. 8:1803, 1988; Scharfman et al., PNAS 88:4626, 1991; Vile et al., Gene Ther. 1:307, 1994; Xu et al., Virol. 171:331, 1989; Yee et al., PNAS 84:5197, 1987). Lo expuesto anteriormente implica utilizar una única unidad de transcripción dentro del genoma del vector y organizar la expresión génica apropiada a partir de secuencias dentro del 5'LTR o a partir de un promotor interno utilizando un LTR autoinactivante, o utilizando la tecnología de eliminación de intrones descrita en el documento WO nº 99/15683.

Según el documento WO nº 98/18934, en el caso de que exista una necesidad de expresar dos proteínas a partir de un único vector retrovírico, resulta preferido expresarlas en forma de proteína de fusión (codificada por una única secuencia de nucleótidos) que utilizar un sitio interno de entrada ribosómica (IRES) para iniciar la traducción de la segunda secuencia codificante en un mensaje policistrónico. Esto se debe a que, según el documento WO nº 98/18934, la eficiencia de un IRES con frecuencia es baja y dependiente del tejido, provocando que la estrategia resulte no deseable si se busca maximizar la eficiencia de la conversión metabólica de, por ejemplo, tirosina hasta dopamina.

1. Genoma de vector lentivírico que comprende tres o más secuencias de nucleótidos de interés ligadas funcionalmente por dos o más sitios internos de entrada ribosómica, en el que las secuencias de nucleótidos de interés codifican una proteína seleccionada de entre el grupo siguiente: tirosina hidroxilasa, GTP-ciclohidrolasa I, aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa y transportador vesicular de monoaminas de tipo 2.

2. Genoma según la reivindicación 1, en el que las secuencias de nucleótidos de interés codifican tirosina hidroxilasa, GTP-ciclohidrolasa I y aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa.

3. Genoma según la reivindicación 1 ó 2, que es derivable del VIH.

4. Genoma según la reivindicación 1 ó 2, que es derivable del VAIE.

5. Genoma según la reivindicación 1 ó 2, en el que el vector lentivírico es un vector lentivírico de no primates.

6. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos una de las secuencias de nucleótidos de interés se encuentra funcionalmente ligada a un promotor o elemento(s) promotor(es).

7. Genoma de vector lentivírico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los intensificadores transcripcionales o intensificadores y promotor en la región U3 de la 3'LTR se delecionan, de manera que tras una ronda de transcripción inversa e integración, estos cambios se copian tanto en las LTR 5' como 3' que producen un provirus transcripcionalmente activo, de manera que el vector lentivírico es autoinactivante.

8. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que carece del elemento sensible a rev.

9. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de cPPT.

10. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un elemento regulador postraanscripcional o un intensificador traduccional.

11. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos una de las secuencias de nucleótidos de interés es una secuencia de ARN/ADN optimizada por codones.

12. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una de las secuencias de nucleótidos de interés comprende una forma truncada del gen de la tirosina hidroxilasa, que carece del dominio regulador.

13. Sistema de vector que comprende un genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

14. Sistema de vector según la reivindicación 13, que comprende: