Clones moleculares con genes mutados GAG/POL de VIH, GAG de VIS y ENV de VIS.

Una construcción de ácido nucleico que comprende una LTR 5', una señal de empaquetamiento,

un gen gag/pollentiviral independiente de Rev del cual se han eliminado los elementos de inestabilidad (INS), un sitio de ayuste, ungen env lentiviral independiente de Rev del cual se han eliminado los INS y una LTR 3', siendo capaz dichaconstrucción de ácido nucleico de producir componentes de virión lentiviral Gag, Pol y Env funcionales.

Clones moleculares con genes mutados GAG/POL de VIH, GAG de VIS y ENV de VIS

I. Campo técnico La invención se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospedadoras que comprenden secuencias de gen gag de VIH-1, pol de VIH-1 y/o gag de VIS mutadas. La invención también se refiere a células hospedadoras que comprenden estas construcciones de ácido nucleico.

II. Antecedentes Hasta hace poco, los protocolos de terapia génica han dependido con frecuencia de vectores obtenidos de retrovirus, tales como virus de la leucemia murina (MLV) . Estos vectores son útiles debido a que los genes que transducen se integran en el genoma de las células diana, una característica deseable para la expresión a largo plazo. Sin embargo, estos vectores retrovirales pueden transducir solamente células en división, lo que limita su uso para transferencia génica in vivo en células que no están proliferando, tales como hepatocitos, miofibras, células madre hematopoyéticas y neuronas.

Los lentivirus son un tipo de retrovirus pueden infectar células tanto en división como que no están en división. Se ha demostrado que son extremadamente eficaces proporcionando expresión génica a largo plazo (durante hasta 6 meses) en una diversidad de células que no están en división (tales como neuronas y macrófagos) en modelos animales. Véase, por ejemplo, Amado et al., Science 285: 674-676 (julio de 1999) . Se ha propuesto que el sistema de transferencia génica óptimo incluiría un vector basado en VIH, u otros lentivirus, que pueda integrarse en el

genoma de células que no están en proliferación. Debido a que los retrovirus se integran en el genoma de las células diana, la transducción repetida es innecesaria. Por lo tanto, al contrario que un vector adenoviral capaz de suministro génico in vivo, se pueden evitar problemas relacionados con la respuesta humoral a antígenos virales inyectados. Véase, por ejemplo, Naldini et al., Science, 272: 263-267 (1996) , pág. 263.

El VIH y otros lentivirus tienen un genoma complejo que, además de los genes estructurales esenciales (env, gag y pol) , contiene genes reguladores (tat y rev) y accesorios (vpr, vif, vpu y nef) . El VIH ha evolucionado para infectar de forma eficaz y expresar sus genes en células humanas y es capaz de infectar células que no están en división tales como macrófagos debido a que su complejo de preintegración puede atravesar la membrana intacta del núcleo en la célula diana. Este complejo contiene, además del ADN vírico, la enzima integrasa, el producto del gen vpr y una proteína codificada por el gen gag denominada matriz. La proteína matriz permite que el complejo de preintegración pase al interior del núcleo para acceder al ADN hospedador. Los lentivirus no pueden transducir de forma eficaz células verdaderamente quiescentes (células en estado G0) . Sin embargo, a diferencia de vectores retrovirales murinos, además de ser capaces de infectar células en división, los vectores basados en VIH pueden conseguir una transducción y expresión eficaz y sostenida de genes terapéuticos en células que no están en división, tales como células madre hematopoyéticas y en células diferenciadas de manera terminal tales como neuronas, fotorreceptores retinianos, músculo y células hepáticas. Véase, por ejemplo, Amado et al. (julio de 1999) y Klimatcheva et al., Frontiers in Bioscience 4: d481-496 (julio de 1999) y las referencias citadas en esos documentos.

Aunque los vectores lentivirales pueden ser vehículos de suministro génico eficaces, existen preocupaciones de 45 seguridad debido a su origen. Por lo tanto, el ámbito ha centrado su atención en el desarrollo de vectores y sistemas de producción con características de seguridad incorporadas para evitar la emergencia de lentivirus con capacidad de replicación (RCL) . Por ejemplo, en la mayoría de las aplicaciones de laboratorio, los vectores lentivirales se crean generalmente en un sistema transitorio en el que una línea celular se transfecta con tres construcciones separadas: una construcción de empaquetamiento, una construcción de transferencia y una construcción de codificación de envuelta. La construcción de empaquetamiento contiene los elementos necesarios para el empaquetamiento del vector (excepto para env) y las enzimas requeridas para generar partículas de vector. La construcción de transferencia contiene secuencias genéticas que actúan en cis necesarias para que el vector infecte la célula diana y para la transferencia del gen terapéutico (o indicador) . El gen env de lentivirus generalmente se deleciona de la construcción de empaquetamiento y, en su lugar, se suministra el gen de envuelta de un virus diferente en un tercer

vector, "el vector que codifica env", aunque se puede usar el gen env de lentivirus si se desea que el vector tenga por objeto infectar células T CD4+. Un gen de envuelta usado de manera común es el que codifica la glucoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) , que puede infectar una amplia diversidad de células y, además, otorga estabilidad a la partícula y permite que el vector se concentre en títulos altos (véase, por ejemplo, Naldini et al., Science 272: 263-267 (1996) y Akkina et al. J. Virol. 70: 2581 (1996) . El uso de tres construcciones separadas y la ausencia de secuencias solapantes entre las mismas minimiza la posibilidad de recombinación durante la producción del vector de lentivirus (transferencia) . Además, debido a que no se expresan proteínas virales por el propio vector lentiviral (transferencia) , no desencadenan ninguna respuesta inmune eficaz contra células que expresan el vector en modelos animales (un problema particular con vectores basados en adenovirus) . Véase, por ejemplo, Amado et al., Science 285: 674-676 (julio de 1999) y las referencias citadas en ese documento. Véase también Naldini et al.

Science 272: 263-267 (1996) .

Los plásmidos de empaquetamiento iniciales contenían la mayoría de los genes de VIH excepto env. En un intento de mejorar la seguridad, se han producido vectores posteriores de VIH en los que el plásmido de empaquetamiento está desprovisto de todos los genes accesorios. Este proceso no interfiere con la producción eficaz de vector y aumenta significativamente la seguridad del sistema debido a que los potenciales RCL carecen de los genes accesorios necesarios para la replicación eficaz de VIH en seres humanos. Aunque estos vectores pueden transducir las líneas celulares con crecimiento detenido y neuronas in vivo, se ha descrito que no transducen de forma eficaz macrófagos. Se cree que el gen accesorio vpr es necesario para la infección por VIH de las células usando estos vectores de VIH. Véase, Zufferey et al., Nature Biotechnol. 15: 871-875 (1997) . Por el contrario, como se analiza más adelante en este documento, los vectores lentivirales basados en VIH de la presente invención no necesitan ningún gen accesorio de VIH para tener la capacidad de infectar macrófagos humanos y las demás células ensayadas.

También se ha descrito el requisito de vpr o vif para la traducción eficaz de células hepáticas. Véase, por ejemplo, Kafri et al., Nature Genet. 17: 314 (1997) . Estos resultados indican que el requisito de genes accesorios para la transferencia génica mediada por lentivirus eficaz depende del tipo de la célula seleccionada como diana, sugiriendo que las aplicaciones futuras de vectores lentivirales pueden implicar construcciones de vector con genes accesorios diferentes, si fuera necesario.

Zufferey et al., (1997) describen un sistema de vector de VIH en el que los genes de virulencia env, vif, vpr, vpu y nef se han delecionado. Este vector atenuado múltiples veces conservó la capacidad de transducir células con el crecimiento detenido y macrófagos obtenidos de monocitos en cultivo y pudo suministrar de forma eficaz genes in vivo al interior de neuronas adultas. Los plásmidos de empaquetamiento que describieron Zufferey et al. (1997) y Naldini et al. (1996) codifican Rev y Tat además de Gag y Pol.

Los vectores lentivirales modificados por ingeniería genética para empaquetarse en viriones en ausencia del gen regulador tat también se han descrito. Véase, por ejemplo, Kim et al., J. Virol. 72: 811-816 (1998) y Miyoshi et al. J. Virol. 72: 8150-8157 (1998) . En estos vectores, se ha retirado el gen tat del plásmido de empaquetamiento. Kim et al. indican que tat no es necesario siempre que el promotor LTR 5' en serie esté sustituido con un promotor constitutivo fuerte. También tienen otras ventajas para la terapia del HIV-1. La sustitución de la LTR de VIH-1 con un promotor de HCMV constitutivo permite el uso de moléculas anti-Tat tales como mutantes transdominantes de Tat o señuelos de elemento de... [Seguir leyendo]

1. Una construcción de ácido nucleico que comprende una LTR 5', una señal de empaquetamiento, un gen gag/pol lentiviral independiente de Rev del cual se han eliminado los elementos de inestabilidad (INS) , un sitio de ayuste, un gen env lentiviral independiente de Rev del cual se han eliminado los INS y una LTR 3', siendo capaz dicha construcción de ácido nucleico de producir componentes de virión lentiviral Gag, Pol y Env funcionales.

2. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, donde la construcción comprende además un gen tat

lentiviral. 10

3. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, donde la construcción comprende además un elemento de transporte de ARN.

4. Una construcción de ácido nucleico que comprende una LTR 5' de VIH o VIS, una señal de empaquetamiento, un

gen gag/pol que comprende la secuencia de la Sec ID Nº 1, un sitio de ayuste 5', un sitio de ayuste 3', un gen env, un gen tat, un elemento de transporte de ARN funcional y una LTR de VIH o VIS 3', siendo capaz dicha construcción de ácido nucleico de producir componentes de virión Gag, Pol y Env funcionales.

5. Un vector que comprende la construcción de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 20

6. Una célula hospedadora transformada que comprende la construcción de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Una célula hospedadora transformada de la reivindicación 6, donde dicha célula es un eucariota. 25

8. La célula hospedadora de la reivindicación 7, donde dicha célula es una célula humana.

9. Una composición farmacéutica que comprende la construcción de ácido nucleico de una cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 30

10. Uso de la construcción de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricación de un medicamento para la inducción de anticuerpos en un mamífero.

11. Uso de la construcción de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricación de un 35 medicamento para la inducción de linfocitos T citotóxicos en un mamífero.

12. Uso de la construcción de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como una vacuna para el tratamiento de SIDA o una enfermedad relacionada con SIDA.

13. La construcción de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un método de vacunación o terapia génica.

14. La construcción de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso como una vacuna para el tratamiento de SIDA o una enfermedad relacionada con SIDA. 45