Producción recombinante de inhibidores de la fusión antivirales peptídicos.

Un proceso para la producción de un péptido antifusogénico como un péptido de fusión de una longitud de aproximadamente 14 a aproximadamente 70 aminoácidos en una célula huésped procariótica,

que se caracteriza porque, en condiciones tal es que se formen cuerpos de inclusión de dicho péptido de fusión,

a) en dicha célula huésped se expresa un ácido nucleico que codifica dicho péptido de fusión que consta de dicho péptido antifusogénico de una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos unido por el extremo N-terminal a un péptido adicional de una longitud de alrededor de 4 a aproximadamente 30 aminoácidos; b) dicha célula huésped se hace crecer en cultivo;

c) se forman dichos cuerpos de inclusión, se recuperan y se solubilizan;

d) se aisla dicho péptido de fusión,

y dicho péptido de fusión es representado por la Id. de Sec. Nº: 2, 11 o 12 y dicho péptido antifusogénico consiste en una secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 7, 9 o 10, o de un fragmento de la misma.

Producción recombinante de inhibidores de la fusión antivirales peptídicos

La invención está relacionada con los métodos para la producción recombinante de péptidos que inhiben la fusión de los virus con las membranas de las células diana. En particular, esta invención está relacionada con la producción recombinante de los inhibidores peptídicos de los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del sarampión (MEV), o virus respiratorio sincitial (RSV).

Antecedentes de la invención

La fusión de los virus con las membranas celulares es un paso esencial para la entrada en las células de los virus con envoltura, tales como el VIH-I, VIH-II, RSV, virus del sarampión, virus de la gripe, virus parainfluenza, virus de la hepatitis y el virus de Epstein-Barr. Después de haber entrado en la célula, la cascada de la replicación viral puede iniciarse resultando en la infección viral.

El VIH es un miembro del género lentivirus, que incluye retrovirus que poseen genomas complejos y partículas con el núcleo de la cápside en forma de cono. Otros ejemplos de lentivirus incluyen el virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV), el virus visna y el virus de la anemia infecciosa equina (VAIE). Como en todos los retrovirus, el genoma del VIH está codificado en RNA, que se transcribe de forma reversa a DNA viral por la transcriptasa reversa viral (RT) al entrar en una nueva célula huésped. Los virus de la influenza y sus mecanismos de entrada a las células se describen en Bullough, PA, y otros, Nature 371 (1994) 37-43.; Carr, CM, y Kim, PS, Cell 73 (1993) 823- 832; y Wilson, IA, et al, Nature 289 (1981) 366-373.

Todos los lentivirus están envueltos por una bicapa lipídica que se deriva de la membrana de la célula huésped. Las glucoproteínas de la superficie expuesta (SU, gp12) se anclan al virus a través de la interacción con una proteína transmembrana (TM, gp41). La bicapa lipídica también contiene varias proteínas de membrana celular derivadas de la célula huésped, incluidos los principales antígenos de histocompatibilidad, la actina y la ubiquitina (Arthur, LO, et al, Science 258 (1992) 1935-1938). Una cobertura matriz que comprende aproximadamente 2 copias de la proteína matriz (MA, p17) recubre la superficie interna de la membrana viral, y una partícula del núcleo de la cápside cónica que comprende cerca de 2 copias de la proteína de la cápside (CA, p24) se encuentra en el centro del virus. La partícula de la cápside encapsida dos copias del genoma viral no reordenado mediante corte y empalme, que se estabiliza como un complejo ribonucleoproteína con casi 2 copias de la proteína de la nucleocápside (NC, p7), y también contiene tres enzimas esenciales codificadas por el virus: la proteasa (PR), la transcriptasa reversa (RT) y la integrasa (IN). Las partículas virales también empaquetan las proteínas accesorias, Nef, Vif y Vpr. Las tres proteínas accesorias adicionales que funcionan en la célula huésped, Rev, Tat y Vpu, no parecen están empaquetadas.

En el caso del VIH, la entrada viral se asocia con las glucoproteínas de la superficie de la envoltura del VIH (Lawless, MK, et al, Biochemistry 35 (1996) 13.697 a 13.78; Y Turner, BG, y Summers, MF, J. Mol Biol. 285 (1999) 1-32). En el caso del VIH-I, esta proteína de superficie se sintetiza como una única proteína precursora de 16 kD, que se escinde mediante una proteasa celular en dos glicoproteínas gp-41 y gp-12. La gp-41 es una proteína transmembrana, y la gp-12 es una proteína extracelular que permanece asociada de forma no covalente con gyp- 41 en forma trimérica o multimérica (Hammarskjóld, M.-L, et al, Biochim. Biophys. Acta 989 (1989) 269-28). El VIH tiene como diana los linfocitos CD4+ debido a que la proteína de superficie CD4 actúa como el receptor celular para el virus VIH-I. La entrada viral en las células depende de la unión de gp-12 a las moléculas receptoras CD4+ en las células, mientras que gp-41 ancla el complejo de glucoproteínas de la cubierta en la membrana viral y media la fusión de membranas (McDougal, JS, et al, Science 231 (1986) 382-385;. y Maddon, PJ, et al, Cell 47 (1986) 333- 348).

La gp41 es la subunidad transmembrana que media la fusión de las membranas viral y celular. El núcleo del ectodominio de gp41 es un paquete de seis hélices compuesto de tres horquillas helicoidales, cada una de ellas formada por una hélice N emparejada con una hélice antiparalela C (Chan, DC, et al, Cell 89 (1997) 263-273; Weissenhorn, W, y otros, Nature 387 (1997) 426^3; Tan, K, et al, Proc Nati Acad Sci EE.UU. 94 (1997) 12.33- 12.38). Las hélices N forman una bobina enrrollada en espiral trimérica interior con tres hendiduras hidrófobas conservadas; y una hélice C se empaqueta en cada una de estas ranuras. Esta estructura probablemente corresponde al núcleo del estado de fusión activa de gp41. Según Chan, D.C, et al, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 95 (1998) 15.613-15.617, hay evidencia de que una cavidad prominente en la bobina espiral de la gp41 del VIH tipo 1 es una diana farmacológica atractiva.

Se asume que el mecanismo por el cual gp-41 media la fusión de la membrana puede implicar la formación de un trímero en la bobina en espiral, que se cree que dirige la transición del reposo al estado fusogénico, como se describe, por ejemplo, para la hemaglutinina del virus de la gripe (Wilson, IA, y otros, Nature 289 (1981) 366-373;. Carr, CM, y Kim, PS, Cell 73 (1993) 823-832; Bullough, PA, et al, Nature 371 (1994) 37-43).

Los péptidos C (péptidos correspondientes a la hélice C) de los virus con envoltura, tales como DP178 y C34, inhiben potentemente la fusión de membranas de ambas cepas adaptadas en el laboratorio y aislamientos primarios de VIH-1 (Malashkevich, VN, et al., Proc Nati Acad Sci EE.UU. 95 (1998) 9134-9139; Wild, CT, et al, Proc Nati Acad Sci EE.UU. 91 (1994) 977-9774). Un ensayo clínico de fase I con el péptido C DP178 sugiere que tiene actividad antiviral in vivo, resultando en la reducción de la carga viral (Kilby, JM, et al., Nature Medicine 4 (1998) 132-137). Las características estructurales del núcleo de la gp41 sugieren que estos péptidos actúan a través de un mecanismo dominante negativo, en el que los péptidos C se unen a la bobina en espiral central de gp41 y dan lugar a su inactivación (Chan, DC, et al., Cell 93 (1998) 681-684).

Dentro de cada interfaz de la bobina en espiral se encuentra una cavidad profunda, formada por un grupo de residuos en la bobina en espiral de la hélice N, que se ha propuesto como diana atractiva para el desarrollo de compuestos antivirales. Tres residuos de la hélice C (Trp-628, Trp-631, y lle-635) se insertan en esta cavidad y realizan múltiples contactos hidrofóbicos. El análisis mutacional indica que dos de los residuos de la hélice N (Leu- Trp-568 y 571) que comprende esta cavidad son críticos para la actividad de fusión de membrana (Cao, J., et al., J. Virol. 67 (1993) 2747-2755). Por lo tanto, los compuestos que se unen con alta afinidad a esta cavidad y evitan el emparejamiento normal de las hélices N y C pueden ser inhibidores eficaces del VIH-1. Los residuos en la cavidad están altamente conservados en los diversos aislamientos de VIH-1. Por otra parte, un péptido C que contiene la región de unión o cavidad es mucho menos susceptible a la evolución de virus resistentes que DP 178, que carece de esta región (Rimsky, LT, et al., J. Virol. 72 (1998) 986-993). Estas observaciones sugieren que los ligandos de alta afinidad dirigidos a la superficie de la bobina en espiral altamente conservada, sobre todo a su cavidad, tendrán una amplia actividad contra diversos aislamientos de VIH y es menos probable que se escapen mutantes resistentes a los fármacos.

Se han descrito estructuras fusogénicas de las proteínas de fusión de la envoltura de la gripe, el virus de la leucemia murina de Moloney y el virus de la inmunodeficiencia de los simios (cit. En Chan, DC, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 95 (1998), de 15613 hasta 15617), el virus respiratorio sincitial humano, Ebola, virus de la leucemia de células T humana y parainfluenza de los simios. Esto indica una estrecha relación entre las familias de los Orthomyxoviridae, paramyxoviridae, retroviridae y otros como filoviridae, en los que la entrada del virus en las células diana la permiten glucoproteínas transmembrana como la gp41 del VIH-1, la hemaglutinina de la gripe, la GP2 del Ébola y otros (Zhao, X., et al, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 97 (2) 14172-14177).

En el estado de la materia, se describen métodos para la preparación de inhibidores peptídicos (péptidos C) (véase, por ejemplo, Root, MJ, et al, Science 291 (21) 884-888. Root et al. describen el péptido C37-H6 que se deriva de VIH-1. HXB2 contiene residuos 625-661. Se expresó de forma recombinante... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para la producción de un péptido antifusogénico como un péptido de fusión de una longitud de aproximadamente 14 a aproximadamente 7 aminoácidos en una célula huésped procariótica, que se caracteriza porque, en condiciones tales que se formen cuerpos de inclusión de dicho péptido de fusión,

a) en dicha célula huésped se expresa un ácido nucleico que codifica dicho péptido de fusión que consta de dicho péptido antifusogénico de una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 aminoácidos unido por el extremo N-terminal a un péptido adicional de una longitud de alrededor de 4 a aproximadamente 3 aminoácidos;

b) dicha célula huésped se hace crecer en cultivo;

c) se forman dichos cuerpos de inclusión, se recuperan y se solubilizan;

d) se aisla dicho péptido de fusión,

y dicho péptido de fusión es representado por la Id. de Sec. N°: 2, 11 o 12 y dicho péptido antifusogénico consiste en una secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. N°: 7, 9 o 1, o de un fragmento de la misma.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque dicho péptido antifusogénico se escinde de dicho otro péptido durante o después de la solubilización de dichos cuerpos de inclusión.

3. Un ácido nucleico que codifica un péptido de fusión de una longitud de alrededor de 14 a aproximadamente 7 aminoácidos que consta de un péptido antifusogénico de una longitud de alrededor de 1 a aproximadamente 5 aminoácidos unido por el exrtemo N-terminal a un péptido adicional de una longitud de aproximadamente 4 a alrededor de 3 aminoácidos, en el que dicho péptido de fusión está representado por el Id. de Sec. N°: 2, 11 o 12 y dicho péptido antifusogénico consiste en una secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. N°: 7, 9 o 1 o de un fragmento de la misma.

4. Un vector de expresión procariota que contiene un ácido nucleico que codifica un péptido de fusión de una longitud de alrededor de 14 a aproximadamente 7 aminoácidos que consta de un péptido antifusogénico de una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 aminoácidos unido en el extremo N-terminal a un péptido adicional de una longitud de alrededor de 4 a aproximadamente 3 aminoácidos, en el que dicho péptido de fusión se representa por el Id. de Sec. N°: 2, 11 o 12 y dicho péptido antifusogénico consiste en una secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. N°: 7, 9 o 1 o de un fragmento de la misma.

5. Una preparación de cuerpos de inclusión de un péptido de fusión de una longitud de aproximadamente 14 a aproximadamente 7 aminoácidos que consta de un péptido antifusogénico de una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 aminoácidos unido en el extremo N-terminal a un péptido adicional de una longitud de aproximadamente 4 a aproximadamente 3 aminoácidos, en el que dicho péptido de fusión está representado por Id. de Sec. N°: 2, 11 o 12 y dicho péptido antifusogénico consiste en una secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. N°: 7, 9 o 1 o de un fragmento de la misma.