TUBO DE REACCION Y METODO DE USO PARA MINIMIZAR LA CONTAMINACION.

Un método para amplificar y detectar materiales de ácido nucleico,

que comprende las etapas de:

a. añadir una muestra sospechosa de contener un material de ácido nucleico objetivo a un recipiente de amplificación (10) junto con reactivos marcados para amplificación de dicho ácido nucleico objetivo sospechoso para formar una mezcla de reacción;

b. sellar la mezcla de reacción dentro de dicho recipiente, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3 (30), cerrando una tapa herméticamente sellada, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3, (20), que tiene una membrana, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3, (28), que es penetrable por una sonda de pipeta, donde el recipiente de amplificación, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3 (10), tiene una bisagra replegable, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3, (30);

c. amplificar el material de ácido nucleico objetivo dentro de dicho recipiente (10);

d. retirar una porción de la mezcla de reacción desde el recipiente de amplificación (10) para detección; y

e. detectar la presencia de ácido nucleico objetivo amplificado por detección de dichos reactivos marcados;

en el que la retirada se realiza perforando la membrana (28) de la tapa con una sonda de pipeta, aspirando la porción de la mezcla de reacción en la pipeta y dispersando la porción en un compartimiento de detección distinto sin destapar el recipiente de amplificación (10), evitando de esta manera que gotas o aerosoles del material amplificado puedan contaminar el medio ambiente, muestras no reaccionadas o reactivos

Tubo de reacción y método de uso para minimizar la contaminación.

Esta invención se refiere a tubos de reacción adecuados para reacciones de amplificación y, en particular, a tubos para uso en instrumentos automáticos de ciclo térmico y detección. La invención se refiere también a método para uso automático de tales tubos.

Esta solicitud se refiere a la solicitud co-propietaria de los Estados Unidos N° de serie 08/141.243, presentada el 22 de Octubre de 2003, titulada Sistema de transporte de tubos y método de uso (expediente 5453 US 01), ahora abandonada.

Antecedentes de la invención

Las técnicas de amplificación para la detección de ácidos nucleicos objetivos en muestras biológicas ofrecen alta sensibilidad y especificidad para la detección de organismos infecciosos y defectos genéticos. Copias de secuencias especificas de ácidos nucleicos son sintetizadas a una tasa exponencial a través de un proceso de amplificación. Ejemplos de estas técnicas son la reacción de la cadena de polimerasa (PCR), descrita en las patentes de los Estados Unidos N° 4.683.202 y 4.683.195 (Mullis); la reacción de la cadena de ligasa (LCR) descrita en la patente EP-A-320 308 (Backman y col.); y LCR de relleno del intersticio (GLCR) o variaciones de las mismas, que se describen en los documentos WO 90/01069 (Segev), EP-A-439.182 (Backman y col.), GB 2.225.112A (Newton y col.) y WO 93/0047 (Birkenmeyer y col.). Otras técnicas de amplificación incluyen Q-Beta Replicasa, como se describe en la literatura; Amplificación por Desplazamiento de la Trenza (SDA), como se describe en la patente EP-A-497 272 (Walter), EP-A-500 224 (Walter, y col.) y en Walter, y col. en Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992); Replicación de Secuencia Auto-sostenida (3SR), como se describe por Fahy, y col. en PCR Methods and Applications 1:25 (1991); Y Amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), como se describe en Kievits, y col. J. Virol. Methods, 35:273-286 (1991).

Estas reacciones, particularmente donde se requiere ciclo térmico, se realizan habitualmente en tubos del tipo micrófugo, tales como tubos SlickSeals^TM disponibles de Nacional Scientific (San Rafael, CA) o en tubos GeneAmp^TM de pared fina disponibles de Perkin-Elmer (Norwalk, CT). Otro tipo de recipiente de reacción es una tira de vasos de reacción micrófugos combinada con una tira de caperuzas de bóveda como se describe en la patente EP-A-488 769 y comercializadas por Perkin-Elmer (Norwalk, CT) como MicroAmp^TM para uso con un ciclador térmico Perkin-Elmer 9600. En un procedimiento típico, después de la realización de la reacción de amplificación, los tubos son abiertos y una porción del producto de reacción amplificada es transferida a un aparato de detección, tal como una placa de microtitulación u otro aparato de detección.

Un problema principal con tales procedimientos de amplificación de ácido nucleico es el riesgo de contaminación cuando se abren los vasos de amplificación. Se puede generar derrame, formación de gotitas y/o aerosoles cuando se retiran las tapa con el fin de retirar una porción del producto de reacción amplificado para análisis de detección. Esto puede dispersar el producto amplificado a través del laboratorio por gotitas transportadas por el aire o sobre equipo y puede contaminar muestras no amplificadas y/o reactivos. Esto conducirá rápidamente a resultados positivos falsos. Deben tomarse precauciones extremas para prevenir tal contaminación. La separación física entre zonas de preparación de las muestras, de amplificación y de detección se ha utilizado habitualmente en la técnica. Es bastante engorroso, costoso y requiere entrenamiento riguroso para prevenir la transferencia de prendas de vestir del laboratorio, guantes, pipetas o equipo del laboratorio entre tales zonas.

La patente de los Estados Unidos 5.229.297 y la patente correspondiente EP-A-0 381 501 (Kodak) describe una cubeta para realizar la amplificación y detección de material de ácido nucleico en un entorno cerrado para reducir el riesgo de contaminación. La cubeta es un dispositivo cerrado que tiene compartimientos que están interconectados por una serie de pasillos. Algunos de los compartimientos son compartimientos de reacción para amplificar trenzas de ADN, y algunos de los compartimientos son compartimientos de detección que tienen un sitio de detección para detectar ADN amplificado. Se pueden prever también compartimientos de almacenamiento para conservar reactivos. Las muestras de materiales de ácidos nucleicos, junto con reactivos de los departamentos de almacenamiento, son cargadas en los compartimientos de reacción a través de los pasillos. Los pasillos que conducen desde el compartimiento de almacenamiento están provistos con válvulas de retención unidireccionales para prevenir que productos amplificados refluyan de retorno al compartimiento de almacenamiento. Las muestra es amplificada en el compartimiento de reacción, y los productos amplificados son transferidos a través de los pasillos de interconexión hasta los sitios de detección en el compartimiento de detección aplicando presión externa a las paredes flexibles del compartimiento para aplastar el producto amplificado desde los compartimientos de reacción a través de los pasillos y dentro de los compartimientos de detección. De manera alternativa, la cubeta puede estar provista con una disposición de pistón para bombear reactivos y/o productos amplificados desde los compartimientos de reacción hasta el compartimiento de detección.

Aunque la cubeta descrita en el documento EP 0 381 501 A2 (Kodak) proporciona un entorno de reacción y de detección cerrado, tiene varios inconvenientes significativos. Por ejemplo, los compartimientos múltiples, los pasillos múltiples, las válvulas de retención y los mecanismos de bombeo presentan una estructura relativamente complicada que requiere mucho esfuerzo de fabricación. Además, la forma y la configuración de la cubeta descrita en el documento EP 0 381 501 A2 no permiten una inserción fácil en dispositivos de ciclo térmico convencionales. Además, los métodos de transferencia de fluido utilizados por a cubeta requieren una fuente de presión mecánica externa, tal como un dispositivo de rodillo aplicado a paredes laterales flexibles o el desplazamiento de pistones pequeños. Los dispositivos de ciclo térmico convencionales no se adaptan fácilmente para incluir tales fuentes de presión externa, y la presión mecánica aplicada a las paredes flexibles puede romper estas paredes, especialmente si la cubeta está desalineada. La rotura de la pared flexible de un compartimiento externo que contiene el producto de reacción amplificado conduciria a contaminación del interior del instrumento y posiblemente de todo el laboratorio. Finalmente, el aparato descrito en esta referencia es bastante limitado en términos de rendimiento de los dispositivos descritos. El sistema no proporciona la flexibilidad deseada para la fabricación.

La publicación de patente francesa N° FR 2 672 301 (a nombre de Larzul) describe un dispositivo de ensayo herméticamente cerrado similar para amplificación de ADN. Tiene también múltiples compartimientos y pasos a través de los cuales se transfieren muestra y/o reactivos. Las fuerzas motrices para transferir fluido se describen como desplazamiento hidráulico, magnético, capilaridad pasiva, gradiente térmico, bomba peristáltica y diferencial de presión inducida mecánicamente (por ejemplo, aplastamiento).

Otros métodos aplicados en la técnica para abordar las cuestiones de contaminación son de naturaleza química. Un método de este tipo se describe en la patente de los Estados Unidos 5.035.996 (Hartley, Life Techologies, Inc.). Implica incorporar en el producto de amplificación una base de ribonucleosido trifosfato (rNTP) o deoxiribonucleosido trifosfato (dNTP) que no se encuentra generalmente en la muestra a analizar: por ejemplo dUTP en el caso de análisis de ADN. El producto amplificado tendrá, por lo tanto, una secuencia que tiene Uracilo en posiciones múltiples. La enzima uracilo ADN glicosilasa (UDG) se añade a muestras antes de la amplificación. Esto provocará la digestión de cualquier producto de reacción contaminante (que contiene uracilo) sin afectar al ADN natural en la muestra.

Este método trabajará para PCR, pero tiene potencial limitado para LCR. Se puede aplicar a LCR de extremo sin punta, y tiene un potencial muy limitado para LCR de intersticio. En LCR de intersticio, no es práctico incorporar más que unas pocas bases de uracilo para rellenar el intersticio. La acción de UDG será solamente en un sitio,...

1. Un método para amplificar y detectar materiales de ácido nucleico, que comprende las etapas de:

a. añadir una muestra sospechosa de contener un material de ácido nucleico objetivo a un recipiente de amplificación (10) junto con reactivos marcados para amplificación de dicho ácido nucleico objetivo sospechoso para formar una mezcla de reacción;

b. sellar la mezcla de reacción dentro de dicho recipiente, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3 (30), cerrando una tapa herméticamente sellada, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3, (20), que tiene una membrana, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3, (28), que es penetrable por una sonda de pipeta, donde el recipiente de amplificación, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3 (10), tiene una bisagra replegable, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3, (30);

c. amplificar el material de ácido nucleico objetivo dentro de dicho recipiente (10);

d. retirar una porción de la mezcla de reacción desde el recipiente de amplificación (10) para detección; y

e. detectar la presencia de ácido nucleico objetivo amplificado por detección de dichos reactivos marcados;

en el que la retirada se realiza perforando la membrana (28) de la tapa con una sonda de pipeta, aspirando la porción de la mezcla de reacción en la pipeta y dispersando la porción en un compartimiento de detección distinto sin destapar el recipiente de amplificación (10), evitando de esta manera que gotas o aerosoles del material amplificado puedan contaminar el medio ambiente, muestras no reaccionadas o reactivos.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende, además, inactivar todo el material de ácido nucleico dejado en el recipiente de amplificación (10) y en el compartimiento de detección dispersando allí un reactivo de inactivación de ácido nucleico desde una pipeta.

3. El método de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la bisagra replegable (30) es flexible.

4. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el recipiente de amplificación (10) es un tubo (10a), donde la membrana (28) tiene un espesor que varía desde 0,00508 cm hasta 0,0381 cm.

5. El método de una o más de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la sonda de pipeta es un tubo metálico fino con un borde biselado.

6. El método de una o más de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende, además, una etapa de colocación del recipiente de amplificación (10) sellado en un instrumento automático de sonda de pipeta para detección automática, en el que la etapa de colocación es anterior a la retirada de la etapa d.

7. El método de una o más de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la membrana (28) tiene un espesor que varía desde 0,00508 cm hasta 0,0254 cm.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la membrana (28) tiene un espesor que varía entre 0,0125 cm y 0,02286 cm.