DISPOSITIVO PARA LA AMPLIFICACIÓN EN CADENA TERMO-DEPENDIENTE DE SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS DIANA.

Dispositivo para la amplificación en cadena termo-dependiente de secuencias de ácidos nucleicos diana La presente invención se refiere al campo de la genética. Más precisamente, la presente invención se refiere a un dispositivo para la amplificación de secuencias nucleicas diana, cartuchos de reacción utilizables en este dispositivo, y modos de utilización de este dispositivo. La presente invención tiene como objetivo principalmente permitir la detección y, llegado el caso, la cuantificación en tiempo real, de secuencias de ácido nucleico diana en una o varias muestras. La detección de secuencias nucleicas diana es una técnica cada vez más utilizada en numerosos campos, y el abanico de aplicaciones de esta técnica está llamado a extenderse a medida que sea más fiable, más económica y más rápida. Así, en salud humana, la detección de ciertas secuencias de ácido nucleico permite en ciertos casos un diagnóstico fiable y rápido de infecciones virales o bacterianas. Igualmente, la detección de ciertas particularidades genéticas puede permitir identificar susceptibilidades a ciertas enfermedades, o establecer un diagnóstico precoz de enfermedades genéticas o neoplásicas. La detección de secuencias nucleicas diana se utiliza también en la industria agroalimentaria, principalmente para asegurar la trazabilidad de los productos, para detectar la presencia de organismos genéticamente modificados e identificarlos, o para efectuar un control sanitario de los alimentos. Los procedimientos de detección basados en los ácidos nucleicos hacen intervenir casi sistemáticamente una reacción de hibridación molecular entre una secuencia nucleica diana y uno o varias secuencias nucleicas complementarias de dicha secuencia diana. Estos procedimientos presentan numerosas variantes como las técnicas conocidas por el experto en la técnica bajo las expresiones técnicas de transferencia (blot, dot blot, Southern blot, Polimorfismo de longitud del fragmento de restricción, etc.), o también como los sistemas miniaturizados sobre los que se fijan previamente las secuencias complementarias de las secuencias diana (biochips). Dentro del marco de estas técnicas, las secuencias nucleicas complementarias se llaman generalmente sondas. Otra variante, que puede constituir en si la base de un procedimiento de diagnosis o no ser más que una etapa suplementaria en una de estas técnicas mencionadas anteriormente (con el fin principalmente de aumentar la concentración de la secuencia diana y por lo tanto la sensibilidad del diagnóstico), consiste en amplificar la secuencia de ácido nucleico diana. Se han descrito varias técnicas que permiten la amplificación específica de una secuencia de ácido nucleico, siendo la más utilizada la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP), o Polymerase Chain Reaction (PCR). Dentro del marco de esta última técnica, se utilizan secuencias nucleicas complementarias de secuencias diana, llamadas cebadores, para amplificar dichas secuencias diana. Las reacciones de PCR implican una repetición de ciclos, cuyo número varía generalmente de 20 a 50, y que están compuestos cada uno de tres fases sucesivas, a saber: desnaturalización, hibridación, elongación. Respectivamente, la primera fase corresponde a la transformación de los ácidos nucleicos bicatenarios en ácidos nucleicos monocatenarios, la segunda fase a la hibridación molecular entre la secuencia diana y los cebadores complementarios de dicha secuencia, y la tercera fase a la elongación de los cebadores complementarios hibridados en la secuencia diana, por una ADN polimerasa. Estas fases se llevan a temperatura específicas: generalmente 95ºC para la desnaturalización, 72ºC para la elongación, y entre 30ºC y 65ºC para la hibridación, según la temperatura de hibridación (Tm) de los cebadores utilizados. También es posible efectuar las etapas de hibridación y la elongación a la misma temperatura (generalmente 60ºC). Una reacción de PCR consiste, por lo tanto, en un encadenamiento de ciclos térmicos repetitivos a lo largo del cual el número de moléculas de ADN diana que sirve de matriz se duplica teóricamente en cada ciclo. En realidad, el rendimiento de la PCR es inferior a 100%, si bien la cantidad del producto Xn obtenido después de n ciclos es: Xn= Xn-1 (1 + rn), donde Xn-1 es la cantidad de producto obtenido en el ciclo anterior, y rn el rendimiento de la PCR en el ciclo n (0 < rn 1). Considerando el rendimiento constante, es decir idéntico para cada ciclo, la cantidad de producto Xn obtenido después de n ciclos a partir de una cantidad inicial Xo es entonces: Xn= X0 (1 + r) n (A) En realidad, el rendimiento r disminuye a lo largo de la reacción de PCR, por el hecho de varios factores, tal como una cantidad limitante de al menos uno de los reactivos necesarios para la amplificación, la inactivación de la polimerasa por esos pasos repetidos a 95ºC, o su inhibición por los pirofosfatos producidos por la reacción. Por el hecho de esta disminución del rendimiento, la cinética de una reacción de PCR presenta primero una fase exponencial (tanto que r es constante), que evoluciona luego hacia una fase plato cuando r disminuye. A lo largo de la fase exponencial, la ecuación (A) anterior es válida, y puede escribirse también: 2   log (Xn) = log (Xo) + n log (1 + r) Así, en la fase exponencial de la PCR, la curva que presenta la cantidad de producto, en escala logarítmica, en función del número de ciclos, es una recta de pendiente (1 + r) y que corta el eje de las ordenadas en un valor igual al logaritmo de la concentración inicial. La medida en tiempo real, de la cantidad de producto obtenido, puede permitir por lo tanto conocer la concentración inicial de la matriz, lo que es particularmente útil en un gran número de aplicaciones, por ejemplo para medir la carga viral de un enfermo, o también para conocer la variabilidad de un transcriptoma. Generalmente, las PCR implican volúmenes de reacción que van de 2 a 50 l y se efectúan en tubos, microtubos, capilares o sistemas conocidos por el experto en la técnica bajo el término microplacas (es decir conjuntos de micro-tubos solidarizados). Cada lote de tubos o de contenedores equivalentes debe llevarse por lo tanto a tres temperaturas que corresponden a las diferentes fases de la PCR, y esto tantas veces como ciclos deseados. La utilización de tubos o de sistemas similares obligan al usuario a efectuar múltiples manipulaciones para preparar tantos tubos y soluciones (conocidas por el experto en la técnica bajo la expresión mix PCR) como secuencias diana se deseen amplificar incluso a partir de una muestra única de ácidos nucleicos, con la excepción de los procedimientos de amplificación multiplex, que permiten la amplificación de varias secuencias diana simultáneamente en el mismo contenedor, bien por la utilización de cebadores dichos poco específicos que pueden hibridarse con varias secuencias diana como por ejemplo la técnica RAPD - polimomorfismo del ADN amplificado aleatoriamente por sus siglas en inglés, bien por la utilización de cebadores específicos pero en un número más importante, permitiendo cada pareja de cebadores utilizada la amplificación de una secuencia diana. Estas amplificaciones multiplex corresponden a casos particulares y no son la norma. Además, no garantizan la ausencia de interacciones de una reacción de amplificación sobre otra, y por razones principalmente de posibles hibridaciones entre los cebadores, no pueden ser limitadas más que en el número de secuencias diana amplificadas por continente. Estas diferentes manipulaciones implican numerosos inconvenientes. En primer lugar, son consumidoras de tiempo. En segundo lugar, no están exentas de riesgo desde el punto de vista de eventuales contaminaciones de un tubo a otro o desde el medioambiente exterior (polvo, bacteria, aerosol o cualquier otro contaminante susceptible de contener moléculas de ácidos nucleicos o moléculas susceptibles de influir sobre la eficacia de la reacción de amplificación). Además, no aseguran una homogeneidad de volumen y de concentración en reactivos de un tubo a otro. Finalmente, imponen la utilización de volúmenes manipulables manualmente, generalmente superiores a 1 l, lo que tiene una incidencia sobre los costes ligados a la realización de las PCR, siendo los reactivos utilizados caros. La utilización de dispositivos concebidos para automatizar al menos parcialmente tales manipulaciones permite paliar algunos de estos inconvenientes. Sin embargo, tales sistemas automatizados son relativamente caros y su utilización generalmente no se ve justificada económicamente, por lo tanto, más que en el caso de las PCR en grandes series, por ejemplo para la secuenciación de los genomas. También existen ciertos sistemas automatizados que permiten realizar reacciones de PCR cinéticas. Como se ha... [Seguir leyendo]

1.- Cartucho de reacción que comprende varias cámaras de reacción (13), un reservorio (11) y canales (12), presentando el cartucho (1) las características siguientes: - el cartucho posee una geometría de revolución, en el cual el reservorio (11) está situado sensiblemente en el centro de dicho cartucho, las cámaras de reacción (13) están repartidas en círculo alrededor de dicho reservorio, y los canales (12) que unen dicho reservorio a dichas cámaras son esencialmente radiales; - el empalme entre los canales (12) y el reservorio (11) se hace en la periferia del reservorio; estando el cartucho de reacción caracterizado porque - cada cámara de reacción está unida al reservorio por un canal (12) que tiene una sección recta comprendida en un círculo de diámetro inferior a 3 mm; - la capacidad del reservorio es inferior a 10 ml; y - el fondo del reservorio es convexo, de manera a asegurar el reparto de un fluido contenido en el reservorio a nivel de la entrada de los canales 2.- Cartucho según la reivindicación 1, en la cual el diámetro de los canales (12) es inferior o igual a 0,2 mm. 3.- Cartucho según la reivindicación 1 ó 2, en el cual la capacidad del reservorio (11) está comprendida entre 0,1 ml y 1 ml. 4.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende entre 20 y 500 cámaras de reacción. 5.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el volumen de las cámaras de reacción está comprendido entre 0,2 y 50 l, preferentemente entre 1 y 10 l. 6.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el fondo del reservorio (11) es cónico. 7.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual las cámaras de reacción (13) están situadas en la periferia de dicho cartucho. 8.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que presenta un diámetro comprendido entre 1 y 10 cm. 9.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual el reservorio (11) está dividido en 2 a 8 sub-reservorios (111 a 118), y cada una de las cámaras de reacción (13) está unida a uno solo de estos subreservorios por un canal (12). 10.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual las cámaras de reacción presentan una profundidad comprendida entre 0,5 y 1,5 mm. 11.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque es de material plástico, y preferentemente de policarbonato. 12.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, cuyo espesor está comprendido entre 0,5 y 5 mm. 13.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el cual el suelo de las cámaras de reacción (13) presenta un espesor comprendido entre 0,05 y 0,5 mm, de forma preferente aproximadamente 0,25 mm. 14.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el cual las cámaras de reacción (13) están cerradas por una pared superior transparente (17). 15.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el cual las cámaras de reacción (13) están provistas de respiraderos (14). 16.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el cual las cámaras de reacción (13) están cerradas. 17.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el cual el reservorio (11) comprende una apertura adaptable a medios (4) de modulación de la presión en dicho reservorio. 18.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el cual cada canal (12) está constituido por al menos dos partes de diámetros diferentes (121 y 122), siendo el diámetro de la segunda parte (122) inferior al de la   primera parte (121), de manera a crear una pérdida de carga en el canal (12). 19.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque cada canal (12) está equipado por una cavidad anti-reflujo (123) a nivel de su empalme con el reservorio (11), estando constituida dicha cavidad anti-reflujo por una porción de canal sensiblemente vertical, de un diámetro superior o igual al del canal (12). 20.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el cual una parte al menos de las cámaras de reacción (13) comprende oligonucleótidos. 21.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el cual cada una de las cámaras de reacción (13) comprende dos cebadores específicos de una secuencia de ácido nucleico para amplificar y, facultativamente, una sonda específica de dicha secuencia. 22.- Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el cual al menos una parte de las cámaras de reacción (13) comprenden reactivos que han sido cargados por depósito líquido seguido de secado, de tal manera que la llegada de un fluido en dichas cámaras de reacción vuelva a poner dichos reactivos en disolución. 23.- Dispositivo para efectuar reacciones enzimáticas y/o de biología molecular que necesita al menos dos temperaturas de incubación diferentes, caracterizado porque comprende: - al menos un cartucho (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22; - al menos una placa calefactora (2) que presenta al menos dos zonas distintas que pueden llevarse a al menos dos temperaturas diferentes; - medios (3) de desplazamiento relativo entre dicho cartucho y dicha placa, que permite una variación cíclica de la temperatura de las cámaras de reacción. 24-. Dispositivo según la reivindicación 23, en el cual la reacción enzimática es una amplificación en cadena termodependiente de secuencias de ácidos nucleicos, y en el cual las zonas de la placa calefactora (2) pueden llevarse a al menos dos temperaturas diferentes, correspondientes a las fases de los ciclos de amplificación de dichos ácidos nucleicos 25.- Dispositivo según la reivindicación 24, caracterizado porque: - se reparten previamente cebadores específicos de secuencias diana a amplificar en las cámaras de reacción (13), - el reservorio (11) está destinado a recibir un fluido compuesto principalmente por una muestra de ácidos nucleicos a analizar y reactivos necesarios a una reacción de amplificación en cadena de la polimerasa, con la excepción de los cebadores, - la placa calefactora (2) presenta tres zonas distintas que pueden llevarse a tres temperaturas distintas, que corresponden a las tres fases de los ciclos de amplificación en cadena de la polimerasa. 26.- Dispositivo según la reivindicación 24 ó 25, para la amplificación en cadena termo-dependiente de secuencias de ácidos nucleicos medida en tiempo real, caracterizado porque comprende medios ópticos (5) de excitación / medida de la fluorescencia, dispuestos de manera a excitar y medir en cada ciclo la fluorescencia del contenido de las cámaras de reacción. 27.- Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el cual las zonas distintas de calentamiento de la placa (2) están repartidas según al menos dos o tres porciones de disco. 28.- Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el cual dicha placa de calentamiento (2) está fija y dicho cartucho (1) es movido gracias a dichos medios de desplazamiento (3). 29.- Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el cual dicho cartucho (1) está fijo y dicha placa calefactora (2) es movido gracias a dichos medios de desplazamiento (3). 30.- Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, en el cual dichos medios de desplazamiento (3) permiten la rotación de dicho cartucho (1) y/o de dicha placa de calentamiento (2). 31.- Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, en el cual el cartucho (1) está en contacto directo con la placa calefactora (2). 32.- Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31, en el cual la placa (2) está provista de un revestimiento que favorece el desplazamiento relativo de dicho cartucho (1) y dicha placa (2). 33.- Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, en el cual la placa calefactora (2) comprende 16   dos o tres termobloques distintos (21, 22 y llegado el caso, 23) unidos a medios de programación de su temperatura. 34.- Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 33, en el cual el cartucho (1) presenta en la parte superior una parte saliente central (181) que comprende una muesca (182) y los medios de desplazamiento (3) incluyen al menos un taco (32) que coopera con dicha muesca (182) para inculcar a dicho cartucho (1) un movimiento rotativo. 35.- Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 34, que comprende medios ópticos (5) de excitación/medida de la fluorescencia dispuestos encima o sobre el lado del cartucho. 36.- Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, que comprende además medios (4) que permiten conducir el fluido presente en el reservorio (11) a las cámaras de reacción (13). 37.- Dispositivo según la reivindicación 36, en el cual dichos medios de conducción (4) incluyen un dispositivo de pistón (41), y el fluido es conducido a las cámaras de reacción por un aumento de la presión. 38.- Dispositivo según la reivindicación 36, en el cual dichos medios de conducción (4) incluyen una bomba (41), y el fluido es conducido a las cámaras de reacción por un reestablecimiento de la presión después del establecimiento de una depresión. 39.- Dispositivo según la reivindicación 38, en el cual las cámaras de reacción (13) del cartucho (1) están cerradas. 40.- Procedimiento de amplificación de ácido nucleico gracias a un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, que comprende las etapas siguientes: - rellenar al menos parcialmente el reservorio (11) con un fluido que contiene una muestra de ácidos nucleicos a analizar, así como todo lo necesario para una reacción de amplificación con la excepción de los cebadores y, llegado el caso, un intercalante fluorescente de los ácidos nucleicos; - repartir dicho fluido en las cámaras de reacción (13) del cartucho (1), en las que se han depositado previamente cebadores y, llegado el caso, una o varias sondas marcadas; - poner en marcha los medios (3) de desplazamiento relativo entre el cartucho y la placa calefactora para conducir sucesivamente y tantas veces como se quiera el contenido de cada cámara de reacción a dos, tres o más temperaturas definidas por las dos, tres o más zonas de dicha placa calefactora (2). 41.- Procedimiento de amplificación según la reivindicación 40, en el que la etapa de repartición del fluido en las cámaras de reacción (13) se efectúa aplicando una depresión en el interior del cartucho, luego restableciendo la presión. 42.- Procedimiento de rellenado en sistema cerrado de las cámaras de reacción (13) de un cartucho (1) según la reivindicación 17, que comprende las etapas siguientes: - rellenar al menos parcialmente el reservorio (11) con un fluido, - conectar el cartucho (1) a los medios (4) de modulación de la presión, - aplicar una depresión en el interior del cartucho, luego restablecer la presión. 17   18   Fig. 2B 19     21   Fig. 7 22   Fig. 9 23   Fig. 10 24   Fig. 11