SINTESIS DEL PEPTIDO T-20 EMPLEANDO FRAGMENTOS INTERMEDIOS DEL PEPTIDO.

Un método para la preparación de un péptido que tiene la secuencia:

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 que comprende los pasos de: (SEQ ID NO:1), (a) suministro de una resina soporte de síntesis en fase sólida de fórmula Z-Q-[SUP], en donde [SUP] es la resina soporte, Q es un radical de glutamina, y Z es un grupo protector del terminal NH 2, y en donde Z-Q está presente sobre [SUP] como un factor de carga de 0,5 ó inferior; (b) copulación de los aminoácidos con Z-Q-[SUP] para proporcionar Z -YTSLIHSLIEESQNQQ-[SUP] ; (c) tratamiento del Z-YTSLIHSLIEESQNQQ-[SUP] para proporcionar un producto de escisión Ac-YTSLIHS LIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2); y (d) empleo del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) para la síntesis del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE KNEQELLELDKWASLWNWF-NH 2 (SEQ ID NO:1)

Síntesis del péptido T-20 empleando fragmentos intermedios del péptido.

La invención se refiere a métodos para la preparación de péptidos T-20 empleando procedimientos en fase sólida y en fase de solución, además de los fragmentos intermedios de péptidos T-20 que pueden emplearse en estos métodos. Más particularmente, la invención se refiere a la preparación de péptidos T-20 empleando dos fragmentos que se sintetizan empleando un método de fase sólida.

En la literatura, están descritos muchos métodos para la síntesis de péptidos (por ejemplo, ver la patente U.S. nº 6.015.881; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4005-4008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4009-4012; Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology ("Péptidos, Química y Biología"), ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 9307-9320; Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 11065-11133, y Andersson et al. (2000) Biopolymers ("Biopolímeros") 55: 227-250. Los distintos métodos de síntesis se diferencian por el estado físico de la fase en la cual tiene lugar la síntesis, a saber, fase líquida o fase sólida.

En la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), un aminoácido o un grupo peptídico se une a un soporte sólido de resina. A continuación, sucesivos aminoácidos con grupos peptídicos se unen al péptido unido a un soporte hasta que se forma el material peptídico deseado. A continuación, el péptido unido al soporte, se escinde típicamente de dicho soporte y se somete a otro procedimiento y/o purificación. En algunos casos, la síntesis en fase sólida produce un producto peptídico maduro; en otros casos el péptido escindido del soporte (es decir, un "fragmento peptídico intermedio") se emplea en la preparación de un gran producto peptídico maduro.

Los fragmentos peptídicos intermedios generados a partir de procedimientos en fase sólida pueden ser copulados juntamente en un procedimiento de síntesis de fase líquida (denominado en la presente como "síntesis en fase de solución"). La síntesis en fase de solución puede ser particularmente útil en casos en los que la síntesis de un péptido útil maduro mediante fase sólida es o bien imposible o bien no es práctica. Por ejemplo, en la síntesis en fase sólida, los péptidos más grandes pueden adoptar eventualmente una configuración irregular mientras siguen unidos todavía a un soporte sólido, con lo cual se obtiene como resultado una pérdida parcial o completa de actividad en el producto final. Así pues, como la cadena del péptido se vuelve cada vez más larga sobre la resina soporte, la eficiencia de los pasos del procedimiento tales como la copulación y la desprotección puede verse comprometida. Esto, a la vez, puede dar por resultado unos tiempos de procesado más largos para compensar estos problemas, además de las pérdidas de incremento en los materiales de partida, tales como los aminoácidos activables, como reactivos, y disolventes. Estos problemas pueden aumentar cuando la longitud del péptido aumenta y por lo tanto, es relativamente inusual encontrar péptidos maduros mayores de 30 aminoácidos de longitud, sintetizados empleando solamente un procedimiento en fase sólida.

En la copulación en fase de solución, dos fragmentos intermedios de péptido, o un fragmento intermedio de péptido, y un aminoácido reactivo se copulan en un disolvente apropiado y normalmente en presencia de reactivos adicionales que promueven la eficiencia y calidad de la reacción de copulación. Los fragmentos intermedios de péptido se preparan reactivamente de manera que el terminal N de un fragmento se copula con el terminal C de otro fragmento, o viceversa. Además los grupos protectores de la cadena, que están presentes durante la síntesis en fase sólida, están habitualmente retenidos sobre los fragmentos durante la copulación en fase de solución para asegurar la reactividad específica de los extremos terminales de los fragmentos. Estos grupos protectores de la cadena lateral no se eliminan típicamente hasta que el péptido maduro ha sido formado.

Para la síntesis de péptidos muy grandes no es inusual para los pasos múltiples de copulación en fase de solución, que éstos se efectúen empleando tres o cuatro o más fragmentos peptídicos intermedios. Mientras el concepto general de las reacciones de copulación extremo-con-extremo en las reacciones en fase de solución es en general teóricamente sencillo cuando se emplean fragmentos peptídicos intermedios múltiples, en la práctica esto sucede muy raramente. Varios factores, tales como las impurezas y el rendimiento del péptido, pueden tener un efecto significativo sobre la calidad y el rendimiento del péptido de longitud completa. Por lo tanto, la síntesis peptídica empleando esquemas híbridos son a menudo estimulados, y en muchos casos es difícil predecir qué problemas van a ser inherentes en un esquema de síntesis hasta que se efectúa la síntesis real.

En algunos casos, la síntesis en fase de solución puede estar afectada por una falta de pureza de los fragmentos peptídicos intermedios siguiendo la síntesis en fase sólida. A este respecto, puede ser necesario someter los fragmentos peptídicos intermedios a un paso de purificación antes de copular los fragmentos en un procedimiento en fase de solución. La purificación, a su vez, puede ocasionar una reducción del rendimiento del fragmento peptídico intermedio, y en consecuencia en el producto peptídico final.

También, el rendimiento del péptido maduro es inversamente proporcional al número de pasos en fase de solución que son necesarios para la síntesis del péptido maduro. En algunos casos, pueden ser necesarios tres, cuatro o más de cuatro, pasos en fase de solución, utilizando productos peptídicos intermedios, para generar un péptido maduro. Cada paso de copulación de la fase de solución adicional, puede dar por resultado un retroceso disminuido en la producción de producto peptídico de longitud completa. Por lo tanto para mejorar el rendimiento global, es generalmente deseable minimizar los pasos que están involucrados en la copulación.

Moderadas mejoras en uno o más pasos en el esquema sintético global, pueden ocasionar mejoras significativas en la preparación del péptido maduro. Estas mejoras pueden proporcionar un gran ahorro global de tiempo y reactivos y pueden mejorar también significativamente la pureza y rendimiento del producto final.

Mientras la discusión de la importancia de las mejoras en la síntesis de híbridos es aplicable a cualquier clase de péptido producido empleando estos procedimientos, es de particular importancia en el contexto de los péptidos que son terapéuticamente útiles y que se fabrican a una escala para el empleo médico comercial. Mientras la síntesis de los productos farmacéuticos de molécula pequeña puede ser relativamente económica, el coste de la síntesis de productos farmacéuticos biomoleculares más grandes, como los péptidos terapéuticos, puede ser en comparación mucho más grande. Debido al coste de los reactivos, el tiempo de síntesis, además de otros factores, muy pocas mejoras en el proceso sintético de estos productos farmacéuticos biomoleculares más grandes puede tener un impacto significativo sobre si es económicamente factible producir dicho producto farmacéutico. Dichas mejoras son necesarias debido a estos altos costes de producción para los productos farmacéuticos biomoleculares más grandes, como se confirma por el hecho de que en muchos casos hay pocas, si es que hay alguna, alternativas terapéuticas adecuadas para este tipo de productos farmacéuticos biomoleculares más grandes.

Esto se ha visto claramente en el caso de péptidos terapéuticos que se emplean para el tratamiento de enfermedades de inmunodeficiencia causadas por una infección retrovírica. Los péptidos que tiene una actividad anti-retrovírica pueden actuar de diferentes maneras, incluyendo la fusión preventiva de las partículas víricas con la célula anfitriona inmune. Existe una gran necesidad de estos nuevos y efectivos péptidos terapéuticos debido a que, en muchos casos, los antivíricos tradicionales empleados se vuelven ineficaces para el tratamiento de estas enfermedades a causa de la resistencia vírica debida a una mutación.

Una prometedora clase de péptidos terapéuticos de utilidad para combatir las enfermedades de la inmunodeficiencia son los inhibidores de la fusión. Este tipo de péptidos terapéuticos puede reducir el título vírico, y aumentar significativamente la calidad de vida de los pacientes...

1. Un método para la preparación de un péptido que tiene la secuencia:

que comprende los pasos de:

(a) suministro de una resina soporte de síntesis en fase sólida de fórmula Z-Q-[SUP], en donde [SUP] es la resina soporte, Q es un radical de glutamina, y Z es un grupo protector del terminal NH₂, y en donde Z-Q está presente sobre [SUP] como un factor de carga de 0,5 ó inferior;

(b) copulación de los aminoácidos con Z-Q-[SUP] para proporcionar Z -YTSLIHSLIEESQNQQ-[SUP] ;

(c) tratamiento del Z-YTSLIHSLIEESQNQQ-[SUP] para proporcionar un producto de escisión Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2); y

(d) empleo del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) para la síntesis del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO:1).

2. El método de la reivindicación 1, en donde en el paso (a), [SUP] comprende grupos tritilo.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde en el paso (a), [SUP], comprende grupos clorotritilo.

4. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en donde Z es un grupo Fmoc.

5. El método de la reivindicación 1, en donde en el paso (a), Z-Q está presente en [SUP] con un factor de carga inferior a 0,5.

6. El método de la reivindicación 5, en donde en el paso (a), Z-Q está presente en [SUP] con un factor de carga entre 0,2 y 0,5.

7. El método de la reivindicación 1, en donde en el paso (b) los aminoácidos están copulados con el Z-Q-[SUP] en una cantidad entre 1 y 1,5 equivalentes.

8. El método de la reivindicación 1, en donde en el paso (d), el Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) se hace reaccionar con un péptido que tiene la secuencia H-EKNEQELLELDKWASL WNWF-NH₂ (SEQ ID NO:4); para proporcionar el péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO:1).

9. El método de la reivindicación 8, en donde el H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO:4) se forma haciendo reaccionar el Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) con fenilalaninamida.

10. Un método para la preparación de un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN WF-NH₂ (SEQ ID NO:1) que comprende los pasos de:

(a) suministro de una resina soporte, de síntesis en fase sólida, de fórmula Z-W-[SUP], en donde [SUP] es la resina soporte, W es un radical de triptófano, y Z es un grupo protector del terminal NH₂, y en donde Z-W está presente sobre [SUP] con un factor de carga de 0,5 ó inferior;

(b) copulación de los aminoácidos con Z-W-[SUP] para proporcionar el Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-[SUP];

(c) tratamiento del Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-[SUP] para proporcionar un producto de escisión Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3); y

(d) empleo del Z-KNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) para la síntesis del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW NWF-NH₂ (SEQ ID NO:1).

11. El método de la reivindicación 10, en donde, en el paso (d), el Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) se hace reaccionar con fenilalaninamida para formar el H-EKNEQELL ELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO:4).

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en donde el H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO:4) se hace reaccionar con el Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) para proporcionar el Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO:1).

13. Un método para la preparación de un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN WF-NH₂ (SEQ ID NO:1), el cual comprende los pasos de:

(a) suministro de los fragmentos intermedios del péptido de las secuencias Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) y Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3), en donde los fragmentos intermedios del péptido han sido sintetizados sobre soportes sólidos empleando un factor de carga de 0,5 ó inferior:

(b) en fase de solución, reacción del Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) con un radical de fenilalanin-amida para proporcionar la secuencia H-EKNEQELLELDKWASL WNWF-NH₂ (SEQ ID NO:4); y

c) en fase de solución, reacción del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) con el H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO:4) para proporcionar el Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK WASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO:1).

14. El método de la reivindicación 13, en donde, en el paso (a) los fragmentos intermedios del péptido han sido sintetizados sobre soportes sólidos empleando un factor de carga inferior a 0,5.

15. El método de la reivindicación 13 ó 14, en donde, en el paso (a) los fragmentos intermedios del péptido han sido sintetizados sobre soportes sólidos empleando un factor de carga entre 0,2 y 0,5.

16. El método de la reivindicación 13, en donde, en el paso (b) los fragmentos intermedios del péptido han sido sintetizados sobre soportes sólidos empleando aminoácidos que han sido copulados en el soporte en una cantidad entre 1 y 1,5 equivalentes.