PROMOTOR DE IL-18BP, SU PREPARACION Y EMPLEO.

Una secuencia de DNA que codifica el promotor de la IL-18BP humana (SEC.

ID Nº: 1), o un fragmento funcional de la misma, o un derivado funcional de la misma, en donde el extremo 3'' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID Nº 5

Promotor de IL-18BP, su preparación y empleo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al promotor de la proteína de unión de interleucina-18 (IL-18BP), a su preparación y a su uso.

Fundamento de la invención

Las proteínas de unión de citocinas (receptores de citocina solubles) son normalmente los dominios de unión del ligando extracelular de sus correspondientes receptores de citocina de la superficie de la célula. Son producidas bien sea mediante ayuste alternativo o por segmentación proteolítica del receptor de la superficie de la célula. Estos receptores solubles han sido descritos en el pasado: por ejemplo, los receptores para IL-6 y IFN? (Novick et al. 1989), TNF (Engelmann et al. 1989 y Engelmann et al. 1990), IL-1 y IL-4 (Maliszewski et al. 1990) y IFNa/ß (Novick et al. 1994, Novick et al. 1992). Una proteína de unión de citocina llamada osteoprotegerina (OPG, también conocida como factor inhibidor de los osteoclastos OCIF), un miembro de la familia de TNFR/Fas, parece ser el primer ejemplo de receptor soluble que existe solamente como proteína segregada (Anderson et al. 1997, Simonet et al. 1997, Yasuda et al. 1998).

Una proteína de unión de interleucina-18 (IL-18BP) fue purificada por afinidad, en una columna IL-18, a partir de orina (Novick et al. 1999). La IL-18BP anula la inducción de IL-18 de IFN?, y la activación de IL-18 de NF-kB in vitro. Además, la IL-18-BP inhibe la inducción del IFN? en ratones inyectados con LPS. El gen de IL-18BP fue localizado en el cromosoma 11 humano, y no pudo encontrarse ningún exón que codifique un dominio transmembrana en la secuencia genómica de 8,3 kb que comprende el gen IL-18BP. Cuatro isoformas de IL-18BP generadas por ayuste de mRNA alternativo han sido encontradas hasta ahora en seres humanos. Fueron denominadas IL-18BP a, b, c, y d, compartiendo todas ellas el mismo término N y difiriendo en el término C (Novick et al. 1999). Estas isoformas varían en su capacidad para unir IL-18 (Kim et al. 2000). De las cuatro, se sabe que las isoformas humanas IL-18BP (hIL-18BP) a y c tienen una capacidad neutralizadora para IL-18. La isoforma de IL-18BP más abundante, la isoforma variante ayustada a, muestra una alta afinidad por IL-18 con una on-rate rápida y una off-rate lenta, y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 0,4 nM (Kim et al. 2000). La IL-18BP se expresa constitutivamente en el bazo (Novick 1999), y circula a concentraciones en el plasma de 2,5 ng/ml (Novick et al. 2001). Los restos implicados en la interacción de la IL-18 con la IL-18BP han sido descritos mediante el uso de modelos computerizados (Kim et al. 2000) y basándose en la interacción entre la proteína similar IL-1ß con la IL-1R tipo I (Vigers et al. 1997). De acuerdo con el modelo de unión de IL-18 a la IL-18BP, se ha propuesto que el resto Glu en posición 42 y el resto Lys en posición 89 de la IL-18 se unen a Lys-130 y Glu-114 de IL-18BP, respectivamente (Kim et al. 2000).

Como se ha indicado, la IL-18 induce el IFN? del que, a su vez, recientemente se ha publicado que induce la generación in vitro de mRNA de IL-18BPa (Muhl et al 2000). Por consiguiente, la IL-18BPa podría servir como señal de "parada", terminando la respuesta inflamatoria.

La IL-18BP es significativamente homóloga respecto de una familia de proteínas codificadas por varios virus de viruela (Novick et al. 1999, Xiang y Moss 1999). La inhibición de la IL-18 por esta IL-18BP viral putativa puede atenuar la respuesta Th1 antiviral inflamatoria.

La IL-18BP en suero es significativamente elevada en la sepsis, lo que indica su papel en la regulación de respuestas inmunitarias in vivo (Novick et al. 2001). En realidad, la IL-18BP es inducida por el IFN? en varias células, sugiriendo que sirve como inhibidor de la retroalimentación negativa de la respuesta inmunitaria mediada por IL-18 (Mughl et al. 2000).

Resultados preliminares indican que el mRNA de IL-18BP se detecta en leucocitos, colon, intestino delgado, próstata y, de un modo particular, en las células del bazo (Novick et al. 1999). Las células componentes del bazo están constituidas por macrófagos, linfocitos y células plasmáticas con células adicionales derivadas de la circulación.

La actividad de elementos que controlan la transcripción, promotores y mejoradores (enhancers), varía considerablemente entre tipos de células distintos. Los promotores y los mejoradores consisten en breves matrices de secuencias de DNA que interaccionan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción (revisado en Dynan y Tjian 1985, McKnight y Tjian 1986, Sassone-Corsi y Borreli 1986 y Maniatis et al. 1987). La combinación de diferentes secuencias de reconocimiento y las cantidades de factores de transcripción afines determinan la eficacia con la que se transcribe un gen dado en un tipo de célula concreto. Muchos promotores eucarióticos contienen dos tipos de secuencias de reconocimiento: la secuencia TATA ("caja TATA") y los elementos promotores secuencia arriba. Se cree que la caja TATA, situada 25-30 pb secuencia arriba del sitio de iniciación de la transcripción, está implicada en dirigir a la RNA polimerasa II para que comience la síntesis de RNA en el sitio correcto. En cambio, los elementos promotores secuencia arriba determinan la velocidad a la que se inicia la transcripción. Los elementos mejoradores pueden estimular la transcripción hasta 1000 veces a partir de los promotores homólogos o heterólogos ligados. Sin embargo, a diferencia de los elementos promotores secuencia arriba, los mejoradores son activos cuando se colocan secuencia abajo del sitio de iniciación de la transcripción o a una considerable distancia del promotor. Muchos mejoradores de genes celulares trabajan exclusivamente en un tejido o tipo de célula particular (revisado por Voss et al. 1986, Maniatis et al. 1987). Además, algunos mejoradores se hacen activos solamente bajo condiciones específicas que son generadas por la presencia de un inductor, tal como una hormona o un ion metálico (revisado por Sassone-Corsi y Borrelli 1986 y Maniatis 1987). A causa de estas diferencias en las especificidades de la células de los mejoradores celulares, la elección de los elementos promotores y mejoradores a incorporar en un vector de expresión eucariótico vendrá determinada por los tipos de células en los que se va a expresar el gen recombinante. En cambio, el uso de un vector prefabricado que contiene un promotor y un mejorador celular específicos puede limitar gravemente los tipos de células en los que puede obtenerse la expresión.

Muchos elementos mejoradores derivados de virus tienen una gama de hospedadores más amplia y son activos en una diversidad de tejidos, aun cuando se observan diferencias cuantitativas significativas entre los diferentes tipos de células. Por ejemplo el mejorador temprano SV40 es activo promiscuamente en muchos tipos de células derivadas de una diversidad de especies de mamíferos, y en consecuencia se han usado vectores que incorporan este mejorador (Dijkema et al. 1985). Otras dos combinaciones de mejorador y promotor que son activas en una amplia gama de células se derivan de la repetición larga (LTR) del genoma del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al. 1982b) y del citomegalovirus humano (Boshart et al. 1985).

Sumario de la invención

La invención se refiere a una secuencia de DNA que codifica el promotor de IL-18BP humana (SEC ID NO: 1), o un fragmento tal como los de las SEC ID NOS 2 o 3, o un derivado funcional de la misma, en donde el extremo 3' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID NO: 5.

Más específicamente, un derivado de acuerdo con la presente invención puede ser el DNA de la invención mutado en uno o más sitios AP1 presentes en un elemento silenciador presente en la secuencia, y la secuencia de DNA puede contener además un gen ligado operativamente al promotor de IL-18BP.

En un aspecto de la invención, el gen puede codificar p. ej. IL-18BP o una proteína heteróloga tal como luciferasa, interferón beta, TNF, eritropoietina, activador del plasminógeno tisular, factor estimulador de la colonia de granulocitos, superóxido de manganeso dismutasa, una inmunoglobulina, o un fragmento de la misma, hormona del crecimiento, y proteínas de unión con el receptor de FSH, hCG, IL-18, hsLDLR y TNF.

La invención proporciona un vector...

1. Una secuencia de DNA que codifica el promotor de la IL-18BP humana (SEC. ID Nº: 1), o un fragmento funcional de la misma, o un derivado funcional de la misma, en donde el extremo 3' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID Nº 5.

2. La secuencia de DNA según la reivindicación 1ª, en la que el derivado está mutado en uno o más de los sitios AP1 presentes en un elemento silenciador presente en la secuencia.

3. La secuencia de DNA según la reivindicación 1ª, en la que el fragmento comprende la SEC ID NO: 2.

4. La secuencia de DNA según la reivindicación 1ª, en la que el fragmento comprende la SEC ID NO: 3.

5. La secuencia de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, que comprende además un intrón.

6. La secuencia de DNA según la reivindicación 5ª, en la que el intrón consiste en el primer intrón de IL-18BP.

7. La secuencia de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que contiene además un gen ligado operativamente al promotor de IL-18BP.

8. La secuencia de DNA según la reivindicación 7ª, en la que el gen codifica IL-18BP.

9. La secuencia de DNA según la reivindicación 7ª, en la que el gen codifica una proteína heteróloga.

10. La secuencia de DNA según la reivindicación 9ª, en la que el gen heterólogo codifica el gen de la luciferasa.

11. La secuencia de DNA según la reivindicación 9ª, en la que el gen heterólogo codifica una proteína elegida entre interferón-beta, TNF, eritropoietina, activador del plasminógeno tisular, factor estimulador de las colonias de granulocitos, superóxido de manganeso dismutasa, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, hormona del crecimiento, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR y proteínas de unión con el receptor del TNF.

12. Un vector que comprende una secuencia de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

13. Una célula hospedadora que comprende un vector según la reivindicación 12ª.

14. Una célula hospedadora según la reivindicación 13ª, que es una célula de mamífero.

15. Una célula hospedadora según la reivindicación 14ª, elegida entre células CHO, WISH, HepG2, Cos, CV-1, HeLA, y Hakat U937.

16. Un método para la producción de una proteína recombinante, que comprende cultivar una célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 15ª, y aislar la proteína recombinante producida.

17. Un vector de virus recombinante que comprende una porción del genoma del virus, un fragmento de DNA que codifica un gen de interés y un fragmento de DNA que comprende una secuencia de DNA que codifica el promotor de IL-18BP humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 6ª, unido operativamente al gen de interés.

18. Un vector de virus recombinante según la reivindicación 17ª, en el que el gen de interés se elige entre interferón-beta, TNF, eritropoietina, activador del plasminógeno tisular, factor estimulador de las colonias de granulocitos, superóxido de manganeso dismutasa, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, hormona del crecimiento, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR y proteínas de unión con el receptor del TNF.

19. Un vector de virus recombinante según la reivindicación 17ª, en el que la porción del genoma del virus pertenece a un virus adenoasociado.

20. Un vector de virus recombinante según la reivindicación 17ª, en el que la porción del genoma del virus pertenece a un retrovirus.

21. Un vector de virus recombinante según la reivindicación 20ª, en el que el retrovirus se elige entre HIV, HFV, MLV, FIV y VSV.

22. Un método in vitro de regulación de la expresión específica de la célula de un gen de interés, que comprende transducir una célula diana de mamífero con un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 17ª a 21ª.

23. Un método según la reivindicación 22ª, en el que la célula diana es una célula troncal hematopoiética.

24. Un método según la reivindicación 22ª, en el que la célula diana es un monocito.

25. Un método según la reivindicación 24ª, en el que la célula diana es un macrófago.

26. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 22ª a 25ª, en el que el gen de interés codifica una proteína que confiere resistencia a la infección por el HIV.

27. El uso del vector de virus recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 17ª a 21ª para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la infección por HIV, trastornos hematopoiéticos tales como SCID, enfermedad granulomatosa crónica y talasemia, y/o de una enfermedad en un individuo que muestra un IFN? elevado en un tejido corporal.

28. El uso según la reivindicación 27ª, en el que el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que muestra un IFN? elevado en un tejido corporal, y comprende además factores IL-6 y/o TNFa y/o IRF y/o C/EBPß.

29. Ratones transgénicos que albergan la secuencia de DNA que codifica una secuencia de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 11ª.

30. El uso de una secuencia de DNA que codifica el promotor de la IL-18BP humana (SEC ID NO: 1), o un fragmento o un derivado funcional de la misma, en donde el extremo 3' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID NO: 5, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una infección por HIV, trastornos hematopoiéticos tales como SCID, enfermedad granulomatosa crónica y talasemia, y/o de una enfermedad en un individuo que muestra un INF? elevado en un tejido corporal.

31. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una secuencia de DNA que codifica el promotor de la IL-18BP humana (SEC ID NO: 1) o un fragmento funcional o un derivado funcional de la misma, en la que el extremo 3' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID NO: 5.