Péptidos de fórmula general (I), donde X está ausente, o bien,

X está presente y es X14 o X14-X15, donde X14 y X15, independientemente entre sí, representan un aminoácido; sus variantes y fragmentos funcionales, y sus sales farmacéuticamente aceptables, tienen la capacidad de unirse a la escurfina e inhibir su actividad biológica, por lo que pueden regular o bloquear la actividad de los linfocitos T reguladores (Treg). De aplicación en el tratamiento de enfermedades infecciosas y neoplásicas

Péptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones.

Campo de la invención

La invención se refiere, en general, a péptidos que tienen la capacidad de unirse a la escurfina y a sus aplicaciones. En particular, la invención se refiere a péptidos inhibidores de la actividad biológica de la escurfina mediante su unión directa a dicha proteína, y que, de este modo, permiten regular o bloquear la actividad de los linfocitos T reguladores (Treg). Dichos péptidos pueden utilizarse en el tratamiento de patologías en las que sea conveniente o necesario regular o bloquear, de forma controlada, la actividad de los linfocitos Treg, tales como enfermedades infecciosas y neoplásicas.

Antecedentes de la invención

A principios de los años 1970 se describió por primera vez la presencia de unos linfocitos T capaces de suprimir las respuestas inmunitarias. En aquel momento se pensó que dicha acción supresora era mediada por una subpoblación celular específica, pero no se consiguió clonar o caracterizar ningún marcador específico de dicha subpoblación y se perdió en parte el interés por este subtipo celular. Sin embargo, en 1995, Sakaguchi y col. (Sakaguchi et al. 1995. J Immunol 155:1151-64) encontraron que una población minoritaria de células CD4+ (10%) que co-expresaban la cadena alfa del receptor para la interleuquina 2 (CD25) era crucial para el control de las células autoreactivas y la autoinmunidad in vivo. Desde entonces, muchos grupos han demostrado que esta subpoblación de células CD4+CD25+, también conocidas como células Treg o linfocitos Treg, son inmunosupresoras (Takahashi et al. 1998. Int Immunol 10:1969-80; Thornton & Shevach. 1998. J Exp Med 188:287-96). Estas células fueron identificadas primero en ratones pero después han sido ampliamente caracterizadas en humanos (Dieckmann et al. 2001. J Exp Med 193:1303-10; Jonuleit et al. 2001. J Exp Med 193:1285-94; Levings et al. 2001. J Exp Med 193:1295-302). Actualmente, la existencia de una subpoblación inmunosupresora específica es aceptada ampliamente por la comunidad científica y se busca la forma de manipular su actividad para su uso clínico. La principal cuestión es cómo podría modularse su actividad.

Los linfocitos Treg son esenciales para la protección frente a las enfermedades autoinmunes y para la prevención del rechazo a los transplantes; por ello, la posibilidad de potenciar su actividad tiene un gran potencial en el tratamiento de las enfermedades autoimmunes y en los transplantes de órganos. Sin embargo, debido a que los tumores expresan autoantígenos, los linfocitos Treg pueden ser capaces de inhibir la activación de respuestas inmunitarias frente al cáncer.

Varios grupos, incluido el de los inventores, han demostrado que la simple eliminación de las células CD4+CD25+ (Treg) por la administración in vivo de anticuerpos deplecionantes facilita la inducción de inmunidad antitumoral y la protección frente al desarrollo del cáncer (Casares et al. 2003. J Immunol 171:5931-9; Onizuka et al. 1999. Cancer Res 59:3128-33; Shimizu et al. 1999. J Immunol 163:5211-8; Steitz et al. 2001. Cancer Res 61:8643-6; Sutmuller et al. 2001. J Exp Med 194:823-32). Así, se cree que las células CD4+CD25+ (Treg) están continuamente frenando la activación de los linfocitos T efectores para evitar procesos de autoinmunidad, pero dificultando a su vez la correcta activación de una respuesta antitumoral cuando esta es necesaria.

La inmunoterapia alberga grandes esperanzas para el tratamiento de los pacientes con cáncer. Los numerosos protocolos clínicos realizados que han utilizado terapias basadas en citoquinas, infusiones de células T efectoras o protocolos de vacunación han demostrado que, en general, la inmunoterapia del cáncer es segura. Sin embargo, aunque en estos protocolos clínicos se ha observado la inducción de respuestas inmunitarias tras los tratamientos, la mayoría de los pacientes son incapaces de desarrollar una inmunidad antitumoral eficaz. Un metaanálisis de 37 protocolos clínicos de vacunación independientes que incluyen a más de 700 pacientes, ha revelado que el porcentaje de respuestas parciales o completas frente al tumor es muy bajo (3,8%) (Rosenberg et al. 2004. Nat Med 10:909-15). La reciente demostración de la presencia de linfocitos Treg en el tejido tumoral o en los nódulos linfáticos de pacientes con melanoma (Wang, H. Y., J Immunol, 2005. 174:2661-2670; Viguier, M., F. J Immunol, 2004. 173:1444-1453.), cancer de pulmón (Woo, E. Y., Cancer Res 61:4766-4772), ovario (Woo, E. Y., Cancer Res, 2001. 61:4766-4772, Curiel, T. J., Nat Med, 2004. 10:942-949), páncreas y mama (Liyanage, U. K., J Immunol, 2002. 169:2756-2761) así como en hepatocarcinomas (Ormandy, L. A. Cancer Res, 2005. 65:2457-2464; Kobayashi, N., Clin Cancer Res, 2007. 13:902-911) y la descripción de que el tejido tumoral secreta quimiocinas que atraen específicamente a esta subpoblación hacia el tejido tumoral indican que el acceso de los linfocitos Treg al tumor es un proceso dinámico y que ejerce un efecto inmunosupresor que facilita la progresión de la enfermedad. La presencia de Treg en el tumor así como en los nódulos perifércios podría explicar la baja eficacia de los protocolos de inmunoterapia. Del mismo modo, en enfermedades infecciosas, el control ejercido por los linfocitos Treg puede limitar la magnitud de las respuestas efectoras T y provocar el fallo en el control de la infección. Así se ha descrito que algunos virus como el de la hepatitis B (Xu, D. J Immunol, 2006. 177:739-747), hepatitis C (Boettler, T., J Virol, 2005. 79:7860-7867; Cabrera, R. Hepatology, 2004. 40:1062-1071; Rushbrook, J Virol, 2005. 79:7852-7859; Sugimoto, K. Hepatology, 2003. 38:1437-1448) y HIV, (Aandahl, E. M. J Virol, 2004. 78:2454-2459; Kinter, A. L. J Exp Med, 2004. 200:331-343; Oswald-Richter, K. PLoS Bio12004. 2:E198; Weiss, L. Blood, 2004. 10⁴:3249-3256) pueden servirse de los linfocitos Treg para bloquear la respuesta inmunitaria antiviral y permitir así el establecimiento de la infección crónica persistente. Por todo ello se cree que la modulación de la acción de los linfocitos Treg puede ser esencial en el desarrollo de inmunoterapias frente al cáncer o frente a las enfermedades infecciosas.

Existe cierta controversia en cuanto al modo de acción de los linfocitos Treg, pero parece cada vez más consistente el papel que juega la citoquina TGF-ß (factor transformante de crecimiento ß) en el proceso de inhibición de las células T efectoras (Powrie et al. 1996. J Exp Med 183:2669-74; Somasundaram et al. 2002. Cancer Res 62:5267-72).

Por otro lado, recientemente se ha descrito que el factor de transcripción escurfina (FOXP3, producto de expresión del gen foxp3) (Yagi et al. 2004. Int Immunol 16:1643-56. 2004 Oct 04), es esencial para la actividad de los linfocitos Treg, de manera que su presencia determina la actividad supresora de estas células. Las secuencias de cDNA que codifican para escurfina murina y humana han sido objeto de la patente norteamericana US 6.414.129 que, además, describe que la modulación de la expresión de la escurfina puede tener efectos terapéuticos en diversas enfermedades; en dicha patente también se menciona el empleo de péptidos sintéticos, entre otras moléculas, para regular la expresión del gen foxp3, pero no menciona nada sobre la posibilidad de inhibir la actividad de la escurfina ya expresada.

Asimismo, se ha descrito el uso de un método de potenciación de la respuesta inmune en mamíferos basado en la eliminación de los linfocitos Treg mediante el empleo de anticuerpos monoclonales neutralizantes (WO 2006/044864); sin embargo, dicha solicitud de patente no menciona nada sobre la regulación transitoria de la actividad de los linfocitos Treg mediante la inhibición de la actividad de la escurfina (esencial en el efecto inmunosupresor de dichas células). Por otra parte, la depleción de linfocitos Treg incrementa el riesgo de inducción de autoinmunidad y el hecho de que tales anticuerpos monoclonales no discriminen entre los linfocitos Treg y los linfocitos T efectores, reduce su aplicación.

En la actualidad, los únicos métodos para inhibir la actividad de los linfocitos Treg que se han descrito de forma experimental pasan por su eliminación, mediante el uso de anticuerpos deplecionantes o mediante el bloqueo de las citoquinas que producen y que pueden ser las responsables de sus actividades (TGF-ß, IL-10), pero no existe ningún inhibidor específico de esta subpoblación celular. Los métodos que se basan en la depleción de las células T reguladoras...

1. Un péptido con capacidad de unión a escurfina, seleccionado entre:

(I)Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X

2. Péptido según la reivindicación 1, que tiene, además, la capacidad de inhibir la actividad biológica de escurfina in vitro y/o in vivo.

3. Péptido según la reivindicación 1, que comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos:

(Ia)Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X₁₄-X₁₅

donde X₁₄ y X₁₅, independientemente entre sí, representan un aminoácido.

4. Péptido según la reivindicación 3, en el que X₁₄ es Ala y X₁₅ es Met.

5. Péptido según la reivindicación 1, que comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos:

(Ib)Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X

donde X es X₁₄, donde X₁₄ representa un aminoácido.

6. Péptido según la reivindicación 5, en el que X₁₄ es Ala.

7. Péptido según la reivindicación 1, seleccionado entre un péptido que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, una variante o fragmento del mismo, y sus sales farmacéuticamente aceptables.

8. Péptido según la reivindicación 1, seleccionado entre un péptido constituido por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

9. Una proteína de fusión que comprende:

10. Proteína de fusión según la reivindicación 9, en la que dicho péptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, o SEQ ID NO: 14.

11. Proteína de fusión según la reivindicación 10, que comprende, además, un péptido espaciador situado entre dicho péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 [péptido (i)] y dicho péptido transportador [péptido (ii)].

12. Proteína de fusión según la reivindicación 10, que comprende, además, una secuencia aminoacídica útil para el aislamiento o purificación de la proteína de fusión de la invención.

13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, que comprende, además de, al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, uno o más, compuestos inhibidores o reguladores de la actividad inmunosupresora de linfocitos Treg diferentes.

15. Empleo de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neoplásica o de una enfermedad infecciosa.

16. Empleo según la reivindicación 15, en el que dicha enfermedad infecciosa se selecciona entre la enfermedad causada por una infección viral, una infección bacteriana, una infección fúngica y una infección parasitaria.

17. Empleo según la reivindicación 16, en el que dicha enfermedad infecciosa se selecciona entre la enfermedad causada por el virus de la hepatitis C y la enfermedad causada por el virus de la hepatitis B.

18. Empleo según la reivindicación 15, en el que dicha enfermedad neoplásica es un papiloma, un adenoma, un lipoma, un osteoma, un mioma, un angioma, un nevus, un teratoma maduro, un carcinoma, un sarcoma o un teratoma inmaduro.

19. Empleo según la reivindicación 19, en el que dicha enfermedad neoplásica es un melanoma, un mieloma, una leucemia, un linfoma de Hodgkin, un basolioma, un espinolioma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de esófago, hepatocarcinoma o cáncer de cuello y cabeza.

20. Empleo de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el tratamiento de una enfermedad neoplásica o de una enfermedad infecciosa.

21. Un ácido nucleico que codifica un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.

22. Una construcción génica que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 21.

23. Construcción génica según la reivindicación 22, que comprende, además, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de dicho ácido nucleico.

24. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 21, o una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23.

25. Una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 21, o una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23, o un vector según la reivindicación 24.

26. Un procedimiento para producir un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende crecer una célula hospedadora según la reivindicación 25 bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido, y, si se desea, recuperar dicho péptido o dicha proteína de fusión.

27. Empleo de un ácido nucleico según la reivindicación 21, o de una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23, en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de una enfermedad neoplásica o de una enfermedad infecciosa.