VECTOR VIRAL Y SUS APLICACIONES.
El vector viral comprende un replicón del virus del Bosque de Semliki (SFV) mutado en la secuencia de nucleótidos que codifica lasubunidad nsp2 de la replicasa de SFV.
Dicho vector viral puede ser utilizado para la generación de líneas celulares estables concapacidad de expresar constitutivamente productos heterólogos deinterés
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/ES2007/000688.
Solicitante: PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA, S.L..
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: NAVARRA.
Inventor/es: SMERDOU PICAZO, CRISTIAN, PRIETO VALTUEUA,JESUS, CASALES ZOCO,ERKUDEN, RODRIGUEZ MADOZ,JUAN ROBERTO, RAZQUIN ERRO,NEREA, CUEVAS LABRADOR,YOLANDA, RUIZ GUILLEN,MARTA.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 28 de Noviembre de 2007.
Fecha Concesión Europea: 25 de Agosto de 2010.
Clasificación PCT:
- C12N15/86 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores virales.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
Fragmento de la descripción:
Vector viral y sus aplicaciones.
Campo de la invención
La presente invención se engloba dentro del campo de la ingeniería genética. Concretamente, la invención se refiere a unos vectores virales mutados y a sus aplicaciones, en particular, en la generación in vitro de líneas celulares estables y la producción de proteínas de forma constitutiva.
Antecedentes de la invención
Se han desarrollado vectores de expresión de alfavirus a partir de diferentes virus, que incluyen el virus Sindbis (SIN) (34), el virus del Bosque de Semliki (SFV) (18) y el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) (25). Normalmente, los vectores de alfavirus están basados en replicones de ARN en los que los genes estructurales se han sustituido por un gen heterólogo.
El replicón del alfavirus contiene una ORF que codifica la replicasa (Rep) vírica en su extremo 5', que se traduce cuando el ARN se transfecta en células eucariotas. La Rep se expresa como una poliproteína que se procesa, posteriormente, en cuatro subunidades (nsps 1 a 4) (30). La Rep sin procesar puede copiar el vector de ARN en una cadena negativa de ARN, un proceso que sólo tiene lugar durante las primeras 3 a 4 horas tras la transfección o infección. Una vez procesada, la Rep utilizará el ARN de cadena negativa como molde para sintetizar más moléculas del replicón. La Rep procesada también puede reconocer una secuencia interna en el ARN de cadena negativa, o promotor subgenómico, a partir del cual sintetizará un ARN de cadena positiva subgenómico que corresponde al extremo 3' del replicón. Este ARN subgenómico se traducirá para producir la proteína heteróloga en grandes cantidades. El ARN del replicón también se puede empaquetar en partículas víricas mediante la co-transfección de las células con uno o más ARN auxiliares que son capaces de proporcionar las proteínas estructurales víricas en trans (2, 4, 8, 25, 29) o utilizando líneas celulares estables empaquetadoras (24).
La replicación de los vectores de alfavirus es citopática en la mayoría de las células de mamífero debido a mecanismos que todavía no se comprenden del todo (3, 9, 13). El efecto citopático inducido por estos vectores está mediado por apoptosis independiente de p53 y, normalmente, se produce entre las 48-72 horas después de la transfección o infección (14). Se sospecha que la nsp2, uno de los 4 componentes de la replicasa viral, podría tener un papel importante en la inducción de la apoptosis (11, 12).
Los vectores citopáticos de alfavirus se han utilizado en una serie de aplicaciones que incluyen la producción y caracterización de proteínas in vitro (33), así como en estudios sobre vacunación y en terapia génica del cáncer (19, 26). Sin embargo, un inconveniente importante de tales vectores virales de tipo silvestre radica en el hecho de que no se puedan utilizar en aplicaciones en las que se desea una expresión duradera del transgén.
Para solventar ese problema, varios grupos han identificado una serie de mutaciones en la replicasa de los alfavirus que pueden convertir esos vectores virales citopáticos en vectores virales no citopáticos, lo que permite una expresión más duradera de los productos recombinantes expresados por el vector viral. Estos estudios han conducido a la generación de vectores no citopáticos derivados de SIN (7, 22), SFV (20-22) y, más recientemente, de VEE y EEE (virus de la encefalitis equina oriental) (23).
La mayoría de las mutaciones no citopáticas detectadas en los alfavirus se han localizado en la subunidad nsp2 de la Rep. Esta proteína contiene un dominio helicasa en el extremo amino y un dominio proteolítico en el extremo carboxilo, estando éste último implicado en el procesamiento de la Rep en sus cuatro subunidades (30). Se ha demostrado que las mutaciones no citopáticas descritas para nsp2 afectan bien al dominio proteolítico de nsp2 o bien a posiciones próximas a los sitios de escisión entre nsp1/2 o nsp2/3, alterando, de este modo, el procesamiento de la Rep.
Un mutante no citopático aislado en SIN, que contenía un sólo cambio de aminoácido (P por L) en la posición 726 en nsp2 (vector de SIN P726L en nsp2), mostró un hiperprocesamiento de la Rep (7). Este mutante fue capaz de establecer replicación continua en células BHK de manera eficaz. La introducción de diferentes cambios de aminoácidos en la misma posición en este mutante demostró que existe una fuerte correlación positiva entre el nivel de replicación del ARN y la citopatogenicidad del vector. Este vector no citopático de SIN se ha utilizado ampliamente in vitro, ya que es capaz de proporcionar una expresión duradera del transgén con buenos niveles de estabilidad y niveles de expresión que eran aproximadamente el 4% de los obtenidos con el vector de SIN original [wild type (wt)] (1). No obstante, a pesar de que dicho vector no es citopático, carece de capacidad para generar líneas celulares estables con altos niveles de expresión. Efectivamente, en líneas celulares generadas con el vector de SIN P726L que portaba el gen LacZ, la expresión del transgén se perdía en el 45% de las células transfectadas después de 5 pases, y sólo se lograba aumentar la estabilidad de la expresión seleccionando clones individuales (1), lo que retrasa considerablemente la obtención de un número elevado de células capaces de expresar el transgén eficientemente. Aun así, esas líneas mantenían unos niveles de expresión bajos (4% de los niveles obtenidos con el vector SIN wt).
Se ha descrito, además, un vector de SFV no citopático que comprende las mutaciones P718T y R649H (R649H/ P718T) en la subunidad nsp2, que expresa el gen pac de resistencia a puromicina aunque no se ha descrito su capacidad para generar líneas celulares estables de alta expresión (Smerdou, C. et al. 2004. Seventh International Symposium on Positive Strand RNA Viruses, S. Francisco, EEUU).
Respecto a los mutantes no citopáticos de SFV descritos por Perri et al. (22), que incluyen los mutantes SF2A (mutación L10T en nsp2) y SF2C (mutación L713P en nsp2), así como el doble mutante PD (S259P y R650D en nsp2) descrito por Lundström et al. (21), es cierto que pueden expresar niveles de proteína similares o incluso superiores a los del virus de tipo silvestre (mutante PD), pero en todos los casos esos mutantes continúan siendo citopáticos (véase el Ejemplo 8 de esta descripción) y no se ha descrito la generación de líneas celulares estables que expresen proteínas heterólogas basadas en dichos vectores virales. Los datos referentes al carácter citopático del vector SFV-PD están apoyados, además, por resultados publicados posteriormente por Lundström et al. (20) en los que se muestra cómo la expresión de β-gal o GFP en células BHK infectadas con un vector SFV-PD que porta LacZ o GFP como gen marcador alcanza un máximo a las 48 horas para después disminuir drásticamente en los 3-4 días siguientes, lo que indica que se está produciendo un efecto citopático en las células (véase la Figura 2 de la referencia citada).
Por tanto, aunque se han descrito mutantes puntuales en el gen que codifica la proteína nsp2 de los alfavirus SIN y SFV y aunque esos mutantes presentan una disminución en la citopatogenicidad, ninguno de dichos mutantes ha mostrado capacidad para generar líneas celulares estables con altos niveles de expresión.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar vectores de alfavirus virales no citopáticos alternativos, útiles para producir líneas celulares estables capaces de producir la proteína heteróloga de forma estable en presencia de selección.
Compendio de la invención
Los vectores de alfavirus pueden expresar niveles elevados de proteínas recombinantes en diferentes tipos de células. Sin embargo, esta expresión es transitoria debido a la naturaleza citopática de la replicación vírica. Para adaptar estos vectores para estudios a largo plazo, se han aislado mutantes no citopáticos del virus Sindbis (SIN), del virus del Bosque de Semliki (SFV) y del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE). La mayoría de estos mutantes contienen cambios en nsp2, una subunidad de la replicasa vírica.
Para generar nuevos vectores de SFV no citopáticos se han introducido las mutaciones descritas para crear un vector de SIN no citopático, en una posición conservada en SFV. Curiosamente, se encontró que un replicón de SFV que contenía la mutación P718T en nsp2 y portaba el gen...
Reivindicaciones:
1. Un vector viral que comprende un replicón del virus del Bosque de Semliki (SFV), en donde dicho replicón comprende (i) la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima replicasa de SFV con las mutaciones P718T y R649H en la subunidad nsp2, (ii) un polinucleótido que comprende un gen de selección, y (iii) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto heterólogo de interés.
2. Vector viral según la reivindicación 1, que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.
3. Vector viral según la reivindicación 1, que comprende:
4. Vector viral según la reivindicación 3, en el que dichos primer y segundo promotores subgenómicos de SFV son iguales.
5. Vector viral según la reivindicación 3, en el que dichos primer y segundo promotores subgenómicos de SFV son diferentes.
6. Vector viral según la reivindicación 1, que comprende, corriente abajo de un promotor subgenómico, una construcción que comprende el polinucleótido que comprende el gen de selección y el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés, fusionados en fase.
7. Vector viral según la reivindicación 6, en el que dicho polinucleótido que comprende el gen de selección está fusionado en fase con el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés, mediante un conector polinucleotídico.
8. Vector viral según la reivindicación 7, en el que dicho conector es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de corte (auto)proteolítico post-traduccional.
9. Vector viral según la reivindicación 8, en el que dicho conector es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una (auto)proteasa que actúa en cis entre las proteínas resultantes de la traducción del gen de selección y de la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés.
10. Vector viral según la reivindicación 9, en el que dicha (auto)proteasa es la autoproteasa 2A del virus de la fiebre aftosa (FMDV).
11. Vector viral según la reivindicación 6, en el que el extremo 3' del polinucleótido que comprende el gen de selección está fusionado en fase al extremo 5' del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés.
12. Vector viral según la reivindicación 6, en el que el extremo 3' del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el producto heterólogo de interés está fusionado en fase al extremo 5' del polinucleótido que comprende el gen de selección.
13. Una línea celular estable con capacidad de expresar constitutivamente productos heterólogos de interés, caracterizada porque es una línea celular transfectada con un vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Un método para la generación in vitro de una línea celular estable según la reivindicación 13, con capacidad de expresar constitutivamente productos heterólogos de interés, que comprende:
15. Un método para la producción in vitro de un producto heterólogo de interés que comprende cultivar una línea celular estable según la reivindicación 13 bajo condiciones que permiten la expresión del producto heterólogo de interés contenido en el vector viral utilizado para generar dicha línea celular estable.
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