La presente invención se refiere al empleo de un polipéptido quecomprende una secuencia correspondiente al dominio EDA de la fibonectina,

un fragmento de dicho dominio EDA capaz de unirse a TL4, o una variante de dicho dominio EDA o fragmento que es capaz e unirse a TLR4 y presenta una homología mayor del 70% con cualqier forma o fragmento natural del dominio EDA, en la elaboraciónde un agente inmunoestimulador. La presente invención se refieretambién a los métodos de producción y las aplicaciones del citad agente

Uso del dominio EDA de fibronectina

5 Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un vector proteináceo para el transporte molecular a células que expresan el receptor RLT4 (receptor 4 de tipo Toll) , la preparación de dicho vector proteináceo y sus aplicaciones, con una particular incidencia en la preparación y uso de composiciones farmacéuticas, particularmente composiciones inmunoterapéuticas para el tratamiento y la prevención de una enfermedad infecciosa y tumoral.

Descripción de la técnica anterior

Los patógenos y el cáncer siguen siendo las causas principales de muerte a nivel mundial. El desarrollo de vacunas

para evitar enfermedades para las cuales no existen actualmente vacunas, tales como SIDA o malaria, o para tratar infecciones crónicas o cánceres, así como la mejora de la eficacia y la seguridad de las vacunas existentes, sigue teniendo una elevada prioridad. En la mayor parte de los casos, el desarrollo de dichas vacunas requiere estrategias capaces de estimular específicamente los linfocitos T citotóxicos CD8+ (LTC) .

Los LTC se activan mediante la presentación a los receptores de linfocitos T (RCT) de péptidos cortos asociados con moléculas I de tipo MHC. Estos complejos I de tipo péptido-MHC están presentes sobre la superficie de las células presentadoras de antígenos (CPA) , que son también capaces de proporcionar señales estimuladoras simultáneas requeridas para la activación óptima de los LTC.

Las células dendríticas (CD) son las CPA más potentes, con una capacidad única para interactuar con los linfocitos T sin exposición previa e iniciar respuestas inmunes primarias, activando los linfocitos T CD8+ citotóxicos y los linfocitos CD4+ auxiliares. Guermonprez y col. han revisado la presentación del antígeno y la estimulación de los linfocitos T por las CD ("Antigen presentation and T cell stimulation by DC". Annu. Rev. Immunol. 2002, 20: 621-627) , que se incluye aquí por referencia.

En ausencia de respuestas inflamatorias e inmunes en curso, las células dendríticas patrullan a través de la sangre, tejidos periféricos, linfáticos, y órganos linfoides secundarios. En los tejidos periféricos, las células dendríticas capturan autoantígenos y no autoantígenos. A continuación se procesan los antígenos internalizados en péptidos proteolíticos, y estos péptidos se cargan sobre moléculas MHC de tipo I y II (para la activación de linfocitos T CD8+ o 35 CD4+, respectivamente) . Este proceso de captura, degradación, y carga del antígeno se denomina presentación del antígeno. Sin embargo, en ausencia de estimulación, las células dendríticas periféricas presentan antígenos de forma bastante ineficaz. La (s) señal (es) del (de los) patógeno (s) o la (s) señal (es) endógena (s) induce (n) células dendríticas que introducen un programa de desarrollo, denominado maduración, que transforma las células dendríticas en activadoras de las CPA y los linfocitos T. Los productos bacterianos y víricos, así como las citocinas inflamatorias y otras automoléculas, inducen la maduración de las células dendríticas a través de la interacción directa con los receptores superficiales celulares dendríticos innatos. Los linfocitos T, a través de las rutas dependientes e independientes de CD40, y las células endoteliales contribuyen a la maduración final de las células dendríticas mediante el contacto directo célula a célula y la secreción de las citocinas. Poco tiempo después de encontrar una señal de peligro se modifican la eficacia de captación del antígeno, el transporte y la degradación

45 intracelular, y el tráfico intracelular de moléculas MHC. Se aumentan la carga peptídica, así como la semivida y la liberación en la superficie celular de moléculas MHC. También aumenta la expresión superficial de las moléculas coestimuladoras de los linfocitos T. De esta manera, las células dendríticas se convierten en las CPA más potentes y son las únicas capaces de activar los linfocitos T sin exposición previa y de iniciar las respuestas inmunes adaptativas. De manera simultánea con las modificaciones de sus capacidades presentadoras de antígenos, la maduración induce también la migración masiva de células dendríticas al exterior de los tejidos periféricos. Las modificaciones en la expresión de los receptores de la quimiocina y las moléculas de adhesión, así como cambios profundos en la organización del citoesqueleto, contribuyen a la migración de las células dendríticas, a través del sistema linfático, hacia los órganos linfoides secundarios.

55 Inducción de la maduración de las células dendríticas

Las células dendríticas responden a dos tipos de señales: reconocimiento directo de patógenos (a través de receptores específicos del reconocimiento de modelos) y la sensibilización indirecta de la infección (a través de las citocinas inflamatorias, compuestos celulares internos, y respuestas inmunes específicas en curso) . En respuesta a estas señales, las células dendríticas se activan e introducen el programa de maduración, que transforma las células dendríticas en estimuladores eficaces de los linfocitos T. Se ha informado al menos de cinco tipos de receptores superficiales que estimulan la maduración de las células dendríticas: (i) receptores de tipo Toll (RLT) (ii) receptores de citocinas, (iii) , moléculas de la familia (TNF-R) del receptor TNF (iv) FcR, y (sensores de muerte celular. Algunos de los estímulos de maduración más eficaces están mediados por la interacción de los RLT (TLR1-9) con sus 65 respectivos ligandos. Kaisho y Akira revisaron los conocimientos acerca de los receptores de tipo Toll ("Toll-like receptors as adjuvant receptors". Biochimica et Biophysica Acta, 2002, 1589: 1-13) . Los RLT se expresan en

macrófagos y células dendríticas así como en otras células tales como los linfocitos B. Se han identificado los ligandos de Los RLT. La mayor parte de estos ligandos se derivan de patógenos, pero no se encuentran en el hospedador, sugiriendo que los RLT son críticos para la sensibilización de los microorganismos invasores. El reconocimiento del ligando por el RLT provoca una rápida activación de la inmunidad innata induciendo la

producción de citocinas proinflamatorias y la regulación en exceso de moléculas coestimuladoras. La inmunidad innata activada conduce posteriormente a una eficaz inmunidad adaptativa. Con respecto a RLT4, los modelos moleculares reconocidos específicamente son (bacterias Gram-) , ácidos lipoteicoicos (bacterias Gram+) , taxol, proteína F (Virus Respiratorio Sincitial) , proteína 60 del choque térmico, y dominio EDA de la fibronectina.

Por tanto, una vacuna candidata capaz de inducir respuestas óptimas de los linfocitos T debe cumplir diversas condiciones. En primer lugar, tiene que dirigir las CPA para liberar epítopos de linfocitos T derivados de antígenos a moléculas MHC de tipo I y/o II. Por tanto, dirigir las CD representaría el principal objetivo en el diseño de nuevos sistemas de liberación para el desarrollo de vacunas. Además el vector ha de liberar las señales apropiadas a las CD para inducir su activación. La liberación del antígeno a las CD sin una señal de maduración induciría la tolerancia

más bien que la activación de los linfocitos T auxiliares y citotóxicos. Además, su eficacia no debe verse afectada por la inmunidad preexistente frente al propio vector.

Una primera aproximación para liberar péptidos antigénicos a moléculas MHC de tipo I y/o II se basa en vacunas de péptidos sintéticos, que contienen epítopos seleccionados capaces de unirse directamente a estas moléculas sobre la superficie de la CPA. En algunos casos estos péptidos han llevado a la protección del tumor o al aclaramiento del virus en modelos de murino, mientras que en otros han llevado a la inducción de la tolerancia. Los ensayos clínicos humanos llevados a cabo con diferentes tipos de péptidos dan lugar a respuestas clínicas al cáncer modestas.

Un gran número de estrategias diferentes están actualmente en desarrollo. Básicamente, se pueden dividir en dos

categorías. El primer tipo se basa en la síntesis del antígeno por la CPA o su liberación activa en el citoplasma de estas células y aprovecha la ruta clásica de procesamiento del antígeno MHC I. El segundo tipo aprovecha de capacidad de la presentación cruzada de la CPA y se basa en antígenos exógenos libres o asociados a células.... [Seguir leyendo]

1. Uso de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre:

a) dominio EDA de fibronectina (EDA) , o

b) un fragmento de dicho dominio EDA capaz de unirse a TLR4, en la fabricación de una composición farmacéutica estimuladora de una respuesta celular inmune frente a un antígeno, en el que dicha composición farmacéutica es una composición de adyuvante inmunoestimulador o una vacuna.

2. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento que corresponde al dominio EDA comprende una secuencia seleccionada entre:

a) aminoácidos 2-91 de la SEQ. ID. NO: 2; 15

b) SEQ. ID. NO: 4; y

c) un fragmento de las secuencias a) y b) capaz de unirse a las células que expresan RLT4.

3. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento que corresponde al dominio EDA comprende una secuencia seleccionada entre: a) aminoácidos 2-57 de la SEQ. ID. NO: 6;

b) SEQ. ID. NO: 8; y c) un fragmento de las secuencias a) y b) capaz de unirse a las células que expresan RLT4.

4. Uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha composición farmacéutica comprende además una o más moléculas de interés.

5. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido y la molécula de interés se unen entre sí en el mismo vector proteináceo; y en el que dicha molécula de interés se selecciona a partir de un antígeno vírico, un antígeno bacteriano, un antígeno fúngico, un antígeno parasítico, un antígeno tumoral, un

determinante antigénico tumoral, y un alérgeno.

6. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque dicho antígeno es un antígeno vírico.

7. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho antígeno es un antígeno vírico procedente del virus de la hepatitis C.

8. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque dicho antígeno es un antígeno

tumoral o un determinante antigénico tumoral. 45

9. Uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dicha composición farmacéutica es para el tratamiento y la profilaxis de una enfermedad infecciosa, tumoral, o una enfermedad alérgica.

10. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque dicha composición farmacéutica es para el tratamiento y la profilaxis de una enfermedad infecciosa.

11. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque dicha composición farmacéutica

es para el tratamiento y la profilaxis de la hepatitis C. 55

12. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque dicha composición farmacéutica es para el tratamiento y la profilaxis de una enfermedad tumoral.

13. un vector proteináceo caracterizado porque este comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se selecciona entre:

a) un dominio EDA de fibronectina (EDA) , o

b) un fragmento de dicho dominio EDA capaz de unirse a RLT4, 65 unido a una molécula de interés seleccionada entre: un antígeno vírico, un antígeno bacteriano, un antígeno fúngico,

un antígeno parasítico, un antígeno tumoral, y un determinante antigénico tumoral.

14. Un vector proteináceo de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho dominio EDA comprende una secuencia seleccionada entre:

a) los aminoácidos 2-91 de la secuencia SEQ. ID. NO: 2;

b) la secuencia SEQ. ID. NO: 4; y

c) un fragmento de las secuencias a) y b) capaz de unirse a las células que expresan RLT4.

15. Un vector proteináceo de acuerdo a la reivindicación 13, caracterizado porque dicho dominio EDA comprende una secuencia seleccionada entre:

a) los aminoácidos 2-57 de la SEQ. ID. NO: 6;

b) la SEQ. ID. NO: 8; y

c) un fragmento de las secuencias a) y b) capaz de unirse a las células que expresan RLT4. 20

16. Un vector proteináceo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque dicha molécula de interés es un antígeno vírico.

17. Un vector proteináceo de acuerdo con la reivindicación 16 caracterizado porque dicha molécula de interés es un 25 antígeno vírico procedente del virus de la hepatitis C.

18. Un vector proteináceo de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque dicho antígeno del virus de la hepatitis C es la proteína NS3 o un fragmento antigénico de dicha proteína.

19. un vector proteináceo de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque dicha secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 10.

20. Un vector proteináceo de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicha molécula de interés se

selecciona entre un antígeno tumoral y un determinante antigénico tumoral. 35

21. Un ácido nucleico modificado caracterizado porque este codifica un vector proteináceo definido en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20.

22. Un ácido nucleico modificado de acuerdo con la reivindicación 21 caracterizado porque este comprende también 40 una secuencia control unida operativamente que regula la expresión del vector proteináceo.

23. Un ácido nucleico modificado de acuerdo con las reivindicaciones 21 o 22, caracterizado porque este comprende la SEQ. ID. NO: 1, o la SEQ. ID. NO: 5.

45 24. Un ácido nucleico modificado de acuerdo con las reivindicaciones 21 o 22, caracterizado porque este comprende la SEQ ID NO: 9.

25. Un vector de expresión para la expresión génica de un vector proteináceo definido en cualquiera de las

reivindicaciones 13-20, caracterizado porque dicho vector de expresión comprende un ácido nucleico modificado 50 definido en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24.

26. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 25, caracterizado porque dicho vector es un vector vírico.

55 27. Una célula hospedadora de expresión caracterizada porque esta comprende un ácido nucleico modificado definido en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, o un vector de expresión definido en las reivindicaciones 25 o

26.

28. Una célula hospedadora de expresión de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizada porque dicha célula 60 hospedadora de expresión es Escherichia coli.

29. Un procedimiento para la producción de un vector proteináceo definido en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, caracterizado porque este comprende cultivar una célula hospedadora de expresión definida en las reivindicaciones 27 o 28 en condiciones que permiten la producción de dicho vector proteináceo y la recuperación

65 del mismo.

30. Uso de un ácido nucleico modificado definido en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, un vector de expresión definido en las reivindicaciones 25 o 26, o una célula hospedadora definida en las reivindicaciones 27 o 28, en la preparación de una composición farmacéutica.

31. Una composición farmacéutica caracterizada porque esta comprende al menos un vehículo farmacéutico aceptable, y al menos uno de los siguientes componentes: i) un vector proteináceo definido en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20; 10 ii) un ácido nucleico modificado definido en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24; iii) un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico modificado definido en las reivindicaciones 25 o 26; o

iv) una célula hospedadora de expresión que comprende también dicho ácido nucleico modificado, definido en las 15 reivindicaciones 27 o 28.

32. Una composición farmacéutica caracterizada porque esta comprende una cantidad de células dendríticas, en la que dichas células dendríticas se han incubado in vitro con al menos uno de los siguientes componentes: 20 i) un vector proteináceo definido en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20; ii) un ácido nucleico definido en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24; o

iii) un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico modificado definido en las reivindicaciones 25 o 26. 25

33. Una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 31 o 32, caracterizada porque la composición es una vacuna o una composición inmunoterapéutica.