La invención se relaciona con sondas capaces de detectar específicamente de microorganismos de los géneros Klebsiella y Raoultella y de los géneros Enterobacter y Pantoea.

Estas sondas pueden ser usadas para la detección de dichos microorganismos en muestras biológicas así como en biopelículas que aparecen en la maquinaria usada en la industria papelera. Adicionalmente, las sondas son útiles para la identificación de compuestos útiles en la eliminación de biopelículas

Métodos y compuestos para la caracterización de la población bacteriana en biopelículas.

Campo técnico de la invención

La invención se relaciona con reactivos adecuados para la detección específica de microorganismos del género que forma parte habitualmente de las biopelículas que aparecen en la maquinaria usada en la industria papelera, particularmente Klebsiella, Raoultella, Enterobacter y Pantoea.

Antecedentes de la invención

Uno de los principales problemas asociados al proceso de fabricación de papel y cartón en la industria papelera es la formación de biopelículas o depósitos de slime o biopelícula que afectan tanto al proceso de fabricación del papel como a la calidad del producto final. Las biopelículas se definen como acumulaciones microbianas inmovilizadas y embebidas en una matriz de un polímero orgánico de origen microbiano (exopolisacáridos), mezclados con fibras, cargas minerales y otros componentes orgánicos e inorgánicos resultantes del metabolismo microbiano. Este problema es más acusado en la actualidad debido a la baja calidad de las fibras recicladas usadas hoy en día como materia prima así como a ciertos procedimientos que se usan actualmente (circuitos cerrados de agua, temperaturas de hasta 50ºC y pH neutro), puesto que proporcionan un microentorno favorable para el crecimiento de bacterias, levaduras y hongos.

La formación de biopelículas resulta en la aparición de defectos en el producto final tales como manchas y agujeros, malos olores y la pérdida de las propiedades ópticas del papel, así como una menor productividad en el proceso de fabricación debido a roturas y tiempos de limpieza y un mayor coste debido a los compuestos químicos usados para el tratamiento de las biopelículas.

Tradicionalmente, las biopelículas se han tratado usando agentes antimicrobianos de amplio espectro. Sin embargo, debido a los problemas medioambientales asociados a dichos tratamientos, es preferible usar tratamientos más específicos que no afectan a todos los microorganismos de forma indiscriminada sino sólo a aquellos que aparecen en las papeleras y que influyen negativamente en la calidad y en el rendimiento del proceso de fabricación de papel. Además, los microorganismos que forman las biopelículas son más resistentes a agentes biocidas que los microorganismos que no forman parte de dichas biopelículas por lo que el tratamiento indiscriminado con agentes biocidas poco específicos puede resultar en una selección de los microorganismos que forman la biopelícula. Uno de los grupos de microorganismos más abundantes en las papeleras son las enterobacterias y, más particularmente, Pantoea agglomerans, Enterobacter sp., Raoultella y Klebsiella sp. (Rätto, M. et al., 2001, Appl. Microbiol. Biotechnol., 57:182-185; Rättö, M. et al., 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 33:359-367 y Väisänen, O.M. et al., 1998, J. Appl. Microbiol., 84:1069-1084).

Sin embargo, la composición bacteriana exacta de las biopelículas depende tanto de la naturaleza de la contaminación bacteriana original como de las condiciones de crecimiento, por lo que la eficacia de un tratamiento puede variar enormemente entre distintas papeleras. Por tanto, la elección del tratamiento adecuado requiere el conocimiento previo de la composición microbacteriana de la biopelícula presente en la papelera.

WO2005045132 describe un método para la detección de microorganismos formadores de biopelículas en un proceso de fabricación de papel o cartón en el que se usan colorantes que identifican la totalidad de la biomasa, colorantes que muestran el número total de células, colorantes de viabilidad que muestran el número de células vivas y sustratos fluorogénicos que permiten detectar la presencia de determinadas actividades enzimáticas. Este método, sin embargo, únicamente proporciona información sobre la presencia de microorganismos en una determinada muestra sin aportar ninguna información sobre la identidad de los microorganismos detectados y, además, requiere el cultivo de los microorganismos antes de poder efectuar la determinación.

EP1350431 describe un método para la identificación de agentes antimicrobianos capaces de inhibir la formación de una biopelícula que incluye, en una primera etapa, la identificación de los microorganismos presentes en una biopelícula mediante la amplificación del ADNr 16S, su secuenciación y la posterior comparación con las secuencias de ADNr 16S disponibles en las bases de datos. Este método sólo permite identificar aquellos microorganismos cuyo ADNr 16S haya sido descrito con anterioridad y, además, no proporciona ninguna información sobre la viabilidad de dichos microorganismos.

Rättö, M. et al. (J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2005, 32:109-114) han descrito un método para la identificación de los microorganismos que forman parte de los depósitos de biopelículas que se forman en la maquinaria empleada para la fabricación de papel mediante secuenciación del ADNr 16S, ribotipaje, ensayos fisiológicos y análisis de ácidos grasos. Sin embargo, este método requiere múltiples ensayos para la caracterización de los microorganismos presentes, no proporciona ninguna información particular sobre qué microorganismos se encuentran formando parte de biopelículas y tampoco proporciona ninguna información sobre la viabilidad de los microorganismos.

Por tanto, es necesario un método que permita la detección de bacterias en su entorno natural, sin necesidad de cultivarlas, a la vez que la identificación de los microorganismos presentes en la muestra. Un método que proporciona una solución a dichos problemas es la hibridación in situ con marcadores fluorescentes (FISH) (Amman, R.I. et al., 1995, Microbiol. Rev., 59:143-149). Sin embargo, esta tecnología se ha utilizado sólo en contadas ocasiones para el estudio de la composición bacteriana de las biopelículas formadas en máquinas de fabricación de papel. Por ejemplo, la tesis doctoral de Kolari, M. ("Attachment mechanisms and properties of bacterial biofilms on non-living surfaces", mayo de 2003, Universidad de Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Applied Chemistry and Microbiology, disponible online en https://oa.doria.fi/handle/10024/3281) describe el uso de FISH para la identificación de D. geothermalis en biopelículas formadas en máquinas usadas en la fabricación de papel mediante el uso de sondas específicas para el ARN 16S de dicho organismo. Kim, S.B. et al. (Water Sci. Technol., 2002, 559-564) describen el uso de FISH para la identificación de Thiothrix sp., en aguas residuales procedentes de industrias papeleras o de tratamiento de aguas, mediante el uso de sondas dirigidas al ADNr 16S.

Sin embargo, ninguno de los métodos descritos hasta la fecha para identificar microorganismos en biopelículas permite la detección simultánea de microorganismos pertenecientes a más de un género. Además, la técnica de FISH presenta las desventajas de que (i) no proporciona ninguna información sobre la viabilidad de los microorganismos analizados y (ii) la sensibilidad viene determinada por el número de copias del ADN diana presentes en la muestra. Por ello, se han desarrollado métodos en los que la técnica de FISH se usa en combinación con otros métodos que si proporcionan información sobre la viabilidad de los microorganismos y que permiten aumentar la sensibilidad de la detección, tales como el recuento de células viables (Armisen,T. et al., 2004, Water Science and Technology, 50:271-275; García-Armisen. T. y Servais, P., 2004, Journal of Microbiological Methods, 58:269-279), la citometría de flujo (Rigottier-Gois, L. et al., 2003, FEMS Microbiology Ecology, 43:237-245), la reacción en cadena de la polimerasa in situ o la tinción con compuestos que sólo son capaces de detectar células vivas, tales como el ioduro de propidio.

Por tanto, es necesario el disponer de técnicas que permitan la caracterización de la población microbiana que forma las biopelículas que no presenten los inconvenientes de los métodos conocidos en el estado de la técnica, es decir, que permitan la caracterización de las especies o géneros de microorganismos presentes en la biopelícula y que, además, proporcionen información sobre su viabilidad.

La identificación de especies presentes en una población bacteriana es posible mediante el empleo de las llamadas sondas de especie, género y familia, que permiten detectar, respectivamente, todos los microorganismos de una determinada especie, de un determinado...

1. Un oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoultella.

2. Un oligonucleótido según la reivindicación 1 que comprende la secuencia correspondiente a las posiciones 434-452 del ADN de los polinucleótidos definidos en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

3. Un oligonucleótido según la reivindicación 2 que consiste en la secuencia SEQ ID NO:3.

4. Una sonda que comprende un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 acoplado a un marcador fluorescente.

5. Una sonda según la reivindicación 4 en la que el resto fluorescente se selecciona del grupo de isotiocianato de fluoresceína (FITC), hexaclorofluoresceina (HEX) y CY3.

6. Un oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies de los géneros Enterobacter y Pantoea.

7. Un oligonucleótido según la reivindicación 6 que comprende la secuencia correspondiente a las posiciones 442-457 del ADN del polinucleótido definido en SEQ ID NO:4 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

8. Un oligonucleótido según la reivindicación 7 que consiste en la secuencia SEQ ID NO:5.

9. Una sonda que comprende un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 acoplado a una marcador fluorescente.

10. Una sonda según la reivindicación 9 en la que el resto fluorescente se selecciona del grupo de isotiocianato de fluoresceína (FITC), hexaclorofluoresceina (HEX) y CY3.

11. Una sonda que comprende un oligonucleótido que hibrida específicamente con la región repetitiva intergénica consenso (ERIC) de organismos de la familia Enterobacteriaceae acoplado a un resto fluorescente.

12. Una sonda según la reivindicación 11 en el que oligonucleótido que hibrida específicamente con la región repetitiva intergénica consenso (ERIC) de organismos de la familia Enterobacteriaceae comprende la secuencia SEQ ID NO:6.

13. Una sonda según la reivindicación 12 en el que oligonucleótido consiste en la secuencia SEQ ID NO:6.

14. Una sonda según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en la que el resto fluorescente se selecciona del grupo de isotiocianato de fluoresceína (FITC), hexaclorofluoresceina (HEX) y CY3.

15. Uso de al menos un oligonucleótido según las reivindicaciones 1 a 3 y 6 a 8 o de una sonda según cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 y 9 a 14 para la detección de enterobacterias.

16. Uso según la reivindicación 15 en el que las enterobacterias pertenecen a un género seleccionado del grupo de Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, y Pantoea.

17. Método para la detección de enterobacterias pertenecientes a los géneros Klebsiella y Raoultella, que comprende