Un método para el diagnóstico in vitro de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para el diagnóstico temprano de EHNA en un sujeto o para determinar la predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA o para determinar la fase o gravedad de EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con dicha afección,

que comprende:

a) cuantificar el nivel de expresión del conjunto de 85 genes, mostrados en la tabla 2 y la tabla 3, en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto, y

b) comparar los niveles de expresión de dichos genes con el nivel de expresión de los mismos genes de una muestra control;

en donde un aumento en los niveles de expresión de los genes de la tabla 2 y un descenso en el nivel de expresión de los genes de la tabla 3, relativo al nivel de expresión de los mismos genes de la muestra control, es indicativo de EHNA o indicativo de predisposición del sujeto a desarrollar EHNA

Métodos de diagnóstico y pronóstico de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).

Campo de la invención

La invención se refiere a marcadores génicos tempranos para esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). Dichos genes se pueden usar en métodos para diagnosticar EHNA, más específicamente para el diagnóstico temprano de EHNA, así como en métodos para diagnosticar hígado susceptible a EHNA y para optimizar estrategias de tratamiento de EHNA.

Antecedentes de la invención

La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una enfermedad progresiva del hígado de etiología desconocida caracterizada histológicamente por la acumulación de ácidos grasos, daño a hepatocitos e inflamación parecida a la hepatitis alcohólica. EHNA es una fase crítica en el proceso que abarca desde la esteatosis hepática a cirrosis e insuficiencia hepática. Un cuidadoso historial de falta de ingesta significativa de alcohol es esencial para establecer este diagnóstico. EHNA es una de las causas más comunes de aminotransferasas elevadas en pacientes remitidos para evaluación a hepatólogos. La obesidad y la diabetes de tipo 2 están asociadas con EHNA. Puesto que la prevalencia de estas enfermedades está en aumento, también se espera que aumente la prevalencia de EHNA y por tanto, esta enfermedad se ha convertido en un asunto público emergente en los Estados Unidos así como en otros países.

Se piensa que EHNA se origina de la interacción de muchos genes diferentes y factores del estilo de vida. Se han implicado el deterioro mitocondrial, estrés oxidativo y desregulación metabólica en la patogénesis de la esteatohepatitis. La evaluación inicial de pacientes en los que se sospecha que existe EHNA, son fatiga y malestar abdominal superior derecho. La hepatomegalia se encuentra en el 90 por ciento de casos. El mejor método para la detección de infiltración grasa del hígado es la ecografía. La principal y con frecuencia única anormalidad analítica es un aumento de las aminotransferasas en suero. La biopsia hepática está indicada en pacientes sintomáticos con aumentos de aminotransferasas en suero de más de 6 meses de duración. Las características histológicas de EHNA que en su mayoría son indistinguibles de las de la hepatitis alcohólica incluyen infiltración grasa macrovesicular, necrosis hepatocelular y degeneración por hinchamiento, hialino alcohólico y reacción inflamatoria.

Como es cierto para otras enfermedades complejas, los factores genéticos que contribuyen al desarrollo de EHNA se pueden identificar más fácilmente combinando estudios en pacientes con EHNA y en modelos animales de la enfermedad. Uno de estos modelos es el ratón deficiente en MAT1A (MAT1A-KO). Aproximadamente a los 3 meses de edad, los hígados de MAT1A-KO tienen histología normal pero son más sensibles a desarrollar esteatosis grave. Estos ratones desarrollan espontáneamente EHNA y carcinoma hepatocelular aproximadamente a los 8 y 15 meses de edad, respectivamente [Lu SC, 2001, PNAS USA 98, 5560-5565]. El gen MAT1A codifica la metionina adenosiltransferasa I y III, las principales enzimas responsables de la síntesis de S-adenosilmetionina (SAMe) en el hígado. Estudios anteriores concluyeron que los pacientes con cirrosis hepática y hepatitis alcohólica son deficientes en la síntesis de SAMe; y que el tratamiento con SAMe mejora la supervivencia en pacientes con cirrosis hepática alcohólica.

En una solicitud de patente anterior (WO2004/055520), los inventores desarrollaron un método para el diagnóstico de EHNA usando marcadores moleculares basados en la determinación proteómica de un conjunto de proteínas detectadas en muestras de tejido hepático, en lugar de una determinación de la huella genómica, como el método divulgado ahora en la presente invención. Ninguno de esos genes se incluye en la presente invención.

Se ha divulgado un método para detectar y cuantificar genes diferencialmente expresados en individuos afectados en la fase cirrótica [Sreekumar R. et al., 2003, Hepatology, Julio 2003, 244-251]. Sin embargo, dicho método no se puede usar para el diagnóstico de EHNA, sino para el diagnóstico de cirrosis.

El diagnóstico temprano de EHNA se ha refrenado por la falta de marcadores tempranos fiables del desarrollo de EHNA. La identificación de genes expresados diferencialmente en EHNA potencialmente útiles como marcadores biológicos o dianas terapéuticas podría producir el desarrollo de nuevas herramientas para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de esta enfermedad.

Es difícil predecir a partir de características clínicas y patológicas estándar la evolución clínica de sujetos susceptibles a EHNA o la de pacientes que padecen EHNA. Sin embargo, es muy importante en el tratamiento de esta población seleccionar y realizar un control y planteamientos terapéuticos apropiados.

El amplio intervalo de subgrupos susceptibles a EHNA y las variaciones en la evolución de la enfermedad limitan la capacidad predictiva del profesional de la salud. Los métodos disponibles para diseñar estrategias para tratar sujetos susceptibles a EHNA son complejos y llevan tiempo. El tratamiento en paciente con sobrepeso consiste en una pérdida de peso gradual moderada. La hiperglucemia y la hiperlipidemia se controlan con medicación. Algunos fármacos tales como antibióticos, ácido ursodesoxicólico y vitamina E se están evaluando. Sin embargo, a pesar de la mejora en pruebas hepáticas, la infiltración grasa detectada mediante ecografía permanece sin cambios. El trasplante de hígado está indicado para pacientes que han desarrollado cirrosis avanzada.

Por tanto, existe una necesidad para el diagnóstico, especialmente para el diagnóstico temprano, pronóstico y tratamiento de EHNA.

Compendio de la invención

Se han analizado datos generados de los perfiles de expresión en todo el genoma (datos de micromatrices) de muestras hepáticas de pacientes con EHNA y de un modelo de ratón de EHNA (MAT1A-KO) para obtener la firma genómica de EHNA. Se ha usado una técnica de análisis que combina bioinformática y métodos estadísticos. Esta firma genómica de EHNA distingue con precisión entre pacientes con EHNA de fase temprana y controles sanos.

Un aspecto de la invención se refiere a un método para diagnosticar in vitro esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en muestras de tejido hepático, basado en la coexpresión de un conjunto de 85 genes que muestran diferencias específicas en la expresión génica entre pacientes y controles. El método permite la evaluación fácil y fiable del riesgo potencial de un sujeto a desarrollar EHNA, lo que significa que permite la determinación de este sujeto, en un grupo de población, para el riesgo de desarrollar EHNA. El sujeto mencionado puede ser un sujeto al que no se le ha diagnosticado previamente EHNA o un sujeto al que se le ha diagnosticado EHNA para confirmar. Como ejemplo, se puede analizar un sujeto al que previamente no se le ha diagnosticado EHNA o que no tiene síntomas para obtener información sobre la posibilidad de que ese sujeto desarrolle EHNA en el futuro. Por lo tanto, en una forma de realización particular, el método permite evaluar la predisposición (diagnóstico temprano) de un sujeto a desarrollar EHNA, mientras que en otra forma de realización particular, el mismo método permite el diagnóstico de confirmación de la existencia de EHNA en un sujeto.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para determinar in vitro la predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA o para determinar la fase o gravedad de EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con dicha afección.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una matriz de ácidos nucleicos en fase sólida. La matriz comprende un conjunto de sondas útiles para detectar e identificar el conjunto de marcadores génicos tempranos de EHNA, que consiste esencialmente en todos los genes mostrados en las tablas 2 y 3, fijados a un sustrato sólido.

Un kit que comprende un conjunto de sondas para detectar e identificar el conjunto de marcadores génicos tempranos de EHNA, opcionalmente fijados en un sustrato sólido, constituye otro aspecto de la presente divulgación.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método in vitro para identificar y/o evaluar la eficacia de un agente potencialmente terapéutico contra EHNA.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la expresión hepática de las 98 sondas humanas de Affymetrix, que corresponden...

1. Un método para el diagnóstico in vitro de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para el diagnóstico temprano de EHNA en un sujeto o para determinar la predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA o para determinar la fase o gravedad de EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con dicha afección, que comprende:

en donde un aumento en los niveles de expresión de los genes de la tabla 2 y un descenso en el nivel de expresión de los genes de la tabla 3, relativo al nivel de expresión de los mismos genes de la muestra control, es indicativo de EHNA o indicativo de predisposición del sujeto a desarrollar EHNA.

2. Método según la reivindicación 1, en donde la muestra a ser analizada es de un sujeto previamente no diagnosticado con EHNA o de un sujeto diagnosticado previamente con EHNA o de un sujeto que recibe tratamiento anti-EHNA o de un sujeto que ha recibido previamente tratamiento anti-EHNA.

3. Método según la reivindicación 1, en donde la cuantificación de dicho nivel de expresión génica se lleva a cabo mediante tecnología de hibridación en micromatrices de ácidos nucleicos en fase sólida.

4. Uso del conjunto de 85 genes, mostrados en la tabla 2 y la tabla 3, para el diagnóstico in vitro de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para el diagnóstico temprano de EHNA en un sujeto o para determinar la predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA o para determinar la fase o gravedad de EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con dicha afección.

5. Una matriz de ácidos nucleicos en fase sólida que consiste en un conjunto de sondas útiles para detectar e identificar todos los genes mostrados en las tablas 2 y 3, fijados a un sustrato sólido, junto con uno o más controles de hibridación.

6. Uso de un kit que comprende un conjunto de sondas para detectar e identificar el conjunto de 85 genes mostrados en las tabla 2 y la tabla 3, en donde el conjunto de sondas comprende, al menos, una sonda para cada gen a ser identificado o una matriz de ácidos nucleicos en fase sólida según la reivindicación 5 para el diagnóstico in vitro de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para el diagnóstico temprano de EHNA en un sujeto o para determinar la predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA o para determinar la fase o gravedad de EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con dicha afección.

7. Un método in vitro para identificar y/o evaluar la eficacia de un agente potencialmente terapéutico contra EHNA, que comprende: