METODO PARA LA DETECCION DE LISTERIA MONOCYTOGENES MEDIANTE PCR A TIEMPO REAL.

Método para la detección de Listeria monocytogenes mediante PCR a tiempo real.

La presente invención se refiere al campo de la seguridad alimentaria; más concretamente describe unos cebadores y una sonda diseñados específicamente para la amplificación y detección de fragmentos concretos del gen hly de Listeria monocytogenes. El diseño de estos cebadores específicos permite desarrollar otros aspectos a los cuales se refiere la invención que son un método para la detección específica de dicha bacteria patógena mediante PCR a tiempo real usando alguno de los citados cebadores y la sonda, o alguno de los citados cebadores y el fluoróforo SYBR green. La invención se refiere asimismo a un kit de diagnóstico que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo dicho método y que permite la determinación de la presencia de L. monocytogenes directamente en muestras alimentarias

Método para la detección de Listeria monocytogenes mediante PCR a tiempo real.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la seguridad alimentaria; más concretamente describe unos cebadores y una sonda diseñados específicamente para la amplificación y detección de fragmentos concretos del gen hly de Listeria monocytogenes. El diseño de estos cebadores específicos permite desarrollar otros aspectos a los cuales se refiere la invención que son un método para la detección específica de dicha bacteria patógena mediante PCR a tiempo real usando alguno de los citados cebadores y la sonda, o alguno de los citados cebadores y el fluoróforo SYBR green. La invención se refiere asimismo a un kit de diagnostico que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo dicho método y que permite la determinación de la presencia de L. monocytogenes directamente en muestras alimentarias.

Antecedentes de la invención

Listeria monocytogenes es un importante patógeno alimentario asociado al cuadro clínico conocido como listeriosis que incluye meningoencefalitis, septicemia y aborto en humanos (Farber, J. M. and Peterson). Su patogenicidad afecta a humanos y animales, causando epidemias o casos de enfermedad esporádicos. Los grupos poblacionales de riesgo son las mujeres embarazadas, recién nacidos, personas inmunodeprimidas y los ancianos (Farber, J. M. and Peterson, P. L. 1991). Estos grupos son particularmente susceptibles de sufrir una infección, sin embargo, en algunos casos personas aparentemente sanas desarrollan la patología clínica tras la ingesta de alimento contaminado con este patógeno. (Schwartz, B., 1989). Su tasa de mortalidad publicada es del 30% (Schlech WF. 2000), la más elevada de entre los patógenos humanos.

Se trata de un microorganismo Gram positivo, anaerobio facultativo que se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza (suelo, agua, vegetación, pescado, aves, insectos y una gran variedad de mamíferos) (Murray, 1998), y también en los alimentos particularmente en productos lácteos y derivados no pasteurizados, y en productos cárnicos. Únicamente en 1998, L. monocytogenes fue el organismo causante del 53,6% de las retiradas de los productos de Clase I y Clase III en USA. (Welbourn, J.,& Williams, J. 1999). Este patógeno posee la habilidad de poder proliferar a temperatura de refrigeración por lo que su eliminación es bastante complicada, especialmente cuando se localiza en lugares poco accesibles, esquinas, líneas de conducción en U, interior de máquinas, sistema de climatización o cámaras de refrigeración, dentro de las líneas de producción de las empresas agroalimentarias.

Existen seis especies de Listeria: Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria seelegeri, Listeria murray, Listeria welshimeri y Listeria innocua, siendo Listeria monocytogenes la única especie implicada en patología humana. Por consiguiente, la detección fiable e inequívoca de Listeria monocytogenes es de gran importancia tanto para la industria alimentaria como para el sector clínico. Concretamente la legislación alimentaria española regula la presencia de este patógeno en el caso de alimentos preparados del grupo A, en un límite no superior a 100 unidades formadoras por gramo en el producto final y para los productos del grupo B, con una especificación de ausencia de L. monocytogenes en 25 gramos de alimento. Por otro lado, la Comisión Internacional de Especificaciones Microbiológicas para alimentos considera que si el microorganismo no excede de 100 unidades formadoras de colonia por gramo en el alimento en el momento del consumo puede ser considerado como aceptable para individuos que no pertenezcan a grupos de riesgo (Jay, J. M. 1996).

Los métodos convencionales, habitualmente utilizados en los laboratorios de rutina, para el análisis de los alimentos y la detección de Listeria monocytogenes utilizan procedimientos muy largos consistentes en fases de enriquecimiento seguidas de aislamiento en medio selectivo y confirmación mediante métodos bioquímicos o serológicos que requieren de al menos una semana para asegurar que un alimento está libre de L. monocytogenes, y de aproximadamente 9 días para confirmar que una microorganismo aislado corresponde a la especie (Sutherland, P.S. and R.J. Porritt. 1997). Este tiempo de análisis resulta inaceptable, especialmente en el caso de productos perecederos que tienen una corta vida y que necesitan salir al mercado antes de conocer los resultados del análisis.

Además, aunque estos métodos han sido mejorados en las últimas décadas, es aún considerable la posibilidad de obtener falsos negativos, especialmente en los lotes de alimentos donde el número de otras Listerias no patogénicas o microorganismos relacionados es muy alta y excede la cantidad de Listeria monocytogenes. (Doyle and Schoeni, 1986).

Algunos de los métodos rápidos actualmente disponibles permiten identificaciones presuntivas en 5 días (Sutherland, P.S. and R.J. Porritt. 1997), pero una de las mayores limitaciones de estos es que tienen una sensibilidad de aproximadamente 10⁵ organismos por gramo por lo que requieren de largos enriquecimientos previos. Este tiempo de respuesta es a menudo insuficiente, especialmente en los programas de análisis de riesgo y control de puntos críticos, donde una detección rápida (respuesta en el mismo día) puede ser útil para la identificación de las fuentes de infección en casos de listeriosis.

Existen numerosos trabajos que aplican la técnica rápida de PCR cualitativa para la detección de Listeria monocytogenes (Elisabeth J. Golsteyn. 1991, M.A.B. Starbuck 1992, Wang Rf, Cao Ww, Johnson Mg 1992, Keith. A. Lampel, Oct. 2000, Karven J. Cooray, 1994, K. Wernars, 1991, L. Rossen, 1991). Este sistema ha sido utilizado con éxito en la identificación de organismos patógenos en muestras clínicas (White, T.J., 1992) y ambientales (Simon T. 1999). Sin embargo, no se encuentra aún implantado para el análisis de alimentos en los laboratorios de rutina debido principalmente al tratamiento que debe de realizarse a las muestras tras el proceso de amplificación para su resolución electroforética en geles de agarosa que posteriormente deben ser teñidos con un agente muy cancerígeno y de difícil manipulación conocido como bromuro de etidio. Todo este tratamiento post-PCR es una fase bastante manual que además puede ser la causa de contaminaciones cruzadas de los productos de amplificación en otras muestras que den origen a falsos positivos.

También se han desarrollado muchas variantes de la técnica como es el caso de la PCR-ELISA (P. Sheu, 1999), que aún simplificando la fase de electroforesis y permitiendo una detección colorimétrica más automatizable mediante el lector de placas ELISA, sigue resultando un método largo debido al tratamiento de la muestra post-PCR para la realización de un inmuno-ensayo (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Otra variante descrita para la detección de Listeria monocytogenes está basada en la detección específica posterior de los productos de amplificación mediante la utilización de una sonda de captura inmovilizada en nitrocelulosa (L. O'connor. 2000). Este método resulta también largo y tedioso ya que utiliza sondas de DNA inmovilizadas en membranas y lleva un tratamiento post-PCR con incubaciones, lavados y revelados de color similares en tiempo y laboriosidad al sistema ELISA anteriormente citado.

También se ha descrito un sistema de PCR múltiple para la detección e identificación simultánea de cuatro especies pertenecientes al género Listeria ssp. (Andreas Bubert, 1999), sin embargo el sistema que plantean necesita de un tratamiento post PCR para la discriminación de los productos de amplificación mediante geles de electroforesis. Además, la adaptación de esta técnica a la detección del patógeno a partir de alimentos es muy delicada con la posibilidad de aparición de bandas de amplificación no claras, según indican los propios autores. Esto hace que el proceso sea difícilmente implantado como sistema de diagnóstico habitual en los laboratorios de análisis.

La novedosa técnica denominada PCR a tiempo real se basa en la lectura a tiempo real de la emisión de fluorescencia emitida por un fluoroforo a medida que se produce la amplificación de las muestras. En una modalidad de PCR a tiempo real se aprovecha la actividad 5'Leftarrow3' exonucleasa de la enzima Taq polimerasa con el fin de romper una sonda que se hibrida interna y específicamente con...

1. Un oligonucleótido aplicable en la detección de la presencia de Listeria monocytogenes en muestras alimenticias caracterizado por la secuencia SEQ ID NO 3.

2. Un oligonucleótido aplicable en la detección de la presencia de Listeria monocytogenes en muestras alimenticias caracterizado por la secuencia SEQ ID NO 4.

3. Un oligonucleótido aplicable en la detección de la presencia de Listeria monocytogenes en muestras alimenticias caracterizado por la secuencia SEQ ID NO 5.

4. Método para la detección de la presencia de Listeria monocytogenes en muestras alimenticias que comprende: