MERTODOS Y COMPOSICIONES PARA ANALIZAR MUTACIONES EN ACIDOS NUCLEICOS Y SUS UTILIZACIONES EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES GENETICAS Y CANCERES.

Método para analizar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en una cadena de ácidos nucleicos emparejados en forma de doble cadena que comprende por lo menos las etapas siguientes:

- poner en contacto en un medio líquido dicha doble cadena, susceptible de incluir por lo menos un emparejamiento erróneo, con por lo menos un compuesto que puede experimentar una interacción específica de emparejamiento de bases con dicho emparejamiento erróneo, utilizándose dicho(s) compuesto(s) en una concentración combinada de por lo menos 10 g/l en dicho medio y estando seleccionado de entre un oligonucléotido que tiene una longitud inferior a 5 nucleótidos, un nucleósido, una base o una mezcla de los mismos y, - analizar dicho emparejamiento erróneo por un método analítico

Métodos y composiciones para analizar mutaciones en ácidos nucleicos y sus utilizaciones en el diagnóstico de enfermedades genéticas y cánceres.

La presente invención se refiere a métodos mejorados para analizar una mutación o mutaciones en ácidos nucleicos, en particular la mutación puntual en ácidos nucleicos de doble cadena.

Los recientes desarrollos en genómica han alcanzado considerables esperanzas de mejoras en la salud humana y en biotecnología.

En medicina, por ejemplo, la comprensión y el diagnóstico de enfermedades genéticas y cánceres, o el estudio de organismos infecciosos, se basan cada vez más en el análisis del ADN y de los ácidos nucleicos.

La biotecnología depende cada vez más de la genética molecular y del análisis de alta resolución de ácidos nucleicos. En particular, la cartografía de las diferencias genéticas entre individuos es de creciente importancia en las investigaciones forenses, aplicaciones médicas, biotecnología e industria alimentaria.

Por ejemplo, detectar mutaciones que conducen a proteínas anómalas puede ser esencial para identificar el origen genético de una enfermedad. Numerosos procesos patológicos hereditarios, pueden diagnosticarse antes del comienzo de los síntomas, utilizando métodos de análisis estructural de ADN. En la investigación del cáncer, por ejemplo, la investigación de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, reconocidos por conducir al aumento fuerte en el cáncer de mama, se realiza actualmente a gran escala. El gen APC es también conocido por conducir a fuerte predisposición al cáncer colorrectal. La identificación genética puede realizarse también en la primera edad, o incluso en el útero, para numerosas enfermedades hereditarias. Actualmente, se han identificado 700 enfermedades genéticas, entre ellas, la talasemia o la miopatía.

La identificación y el análisis detallado de trastornos genéticos adquiridos, tales como los que se presentan en particular en el cáncer, y también aumentando las expectativas de tratamientos más eficaces y personalizados, mediante "cartografía genética" de tumores. La selección genética a gran escala de mutaciones y de variabilidad genética, denominada también "genotipado", es también de importancia primordial para determinar las correlaciones entre las enfermedades y los genes, con objeto de encontrar nuevas dianas para la terapia en un enfoque farmacogenómi- co.

La identificación genética puede utilizarse también para detectar patógenos, incluyendo la identificación de variedades patógenas específicas de aplicaciones en medicina, industria alimentaria, veterinaria o bioterrorismo. Por ejemplo, en la industria alimentaria, la detección del organismo "GMO" modificado genéticamente en el material de partida o en artículos alimenticios es de creciente interés.

Por tanto, existe la necesidad de una metodología para detectar mutaciones en un fragmento de ADN en relación con el tipo natural de manera precisa, reproducible y fiable.

Las moléculas de ADN son polímeros lineales de subunidades llamadas nucleótidos. Cada nucleótido comprende una molécula de azúcar cíclico normal, que está unida por el grupo fosfato al azúcar del nucleótido adyacente, y uno de los diferentes sustituyentes cíclicos denominados bases. La combinación del fosfato y la base se denomina nucleósido. Las cuatro bases encontradas habitualmente en los ADN de procedencia natural son adenina, guanina, citosina y timidina, en lo sucesivo denominadas A, G, C y T, respectivamente. La secuencia lineal de estas bases en el ADN de un individuo es su "genoma". Esto implica zonas de codificación, que llevan la información para la síntesis de proteínas, zonas de regulación de la expresión génica y las zonas denominadas "no codificadoras", cuyo papel no ha sido comprendido completamente.

En el ADN bicatenario, la forma adoptada por el ADN de los cromosomas de todos los organismo celulares, las dos cadenas de ADN están entrelazadas en una configuración helicoidal precisa con las bases orientadas hacia adentro, permitiendo interacciones entre las bases de las cadenas opuestas. Las dos cadenas se mantienen juntas en alineación precisa principalmente por los enlaces de hidrógeno que se permiten entre las bases por una complementariedad de estructuras de pares específicos de bases. Esta complementariedad estructural está determinada por la naturaleza química y las posiciones de los sustituyentes en cada una de las bases, conduciendo en particular a un número definitivo y orientación de los enlaces de hidrógeno. De este modo, en el ADN bicatenario, normalmente cada A en una cadena tiene una interacción de atracción con una T de la cadena opuesta, lo que implica dos enlaces de hidrógeno, y cada G tiene una interacción de atracción con una C opuesta lo que implica tres enlaces de hidrógeno. En principio, garantizan que las moléculas de ADN se replican y se pasan copias exactas a los descendientes de las células durante la reproducción celular (mitosis) o a la descendencia del individuo, cuando la replicación se refiere a los gametos (meiosis).

Ocasionalmente, un emparejamiento de bases incorrecto se produce durante la replicación de la nueva cadena, lo que, después de la replicación posterior de la nueva cadena, produce una descendencia de ADN bicatenario con una secuencia que contiene una diferencia en una sola base hereditaria procedente de la de la molécula de ADN original. Dichos cambios hereditarios se denominan mutaciones genéticas o más específicamente en el presente caso "mutaciones puntuales". La cartografía de las mutaciones genéticas implica tanto la detección de diferencias de secuencia entre las moléculas de ADN que comprenden sustancialmente secuencias de bases idénticas (es decir, homólogas), como también la localización física de esas diferencias dentro de algún subconjunto de las secuencias en las moléculas que se comparan. Las variaciones en las secuencias de ADN, pueden afectar además a zonas no codificadoras. En particular, muy variables, tales como las repeticiones en tándem corto (STR) o el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), existen en zonas no codificadoras, y son muy útiles en el genotipado.

La detección de mutaciones puntuales, y en particular de sustituciones, es particularmente un reto, porque están muy localizadas, y con mucha frecuencia su posición no puede ser conocida de antemano. Realmente, para muchas mutaciones asociadas a enfermedades, la posición exacta de la mutación no es conocida a priori, y la secuencia de codificación completa del gen (que representa generalmente varios millares o decenas de millares de bases) puede ser identificada completamente.

Las tecnologías más destacadas actualmente para el análisis nucleico son la electroforesis capilar y las matrices de hibridación, denominadas también "chips de ADN o ARN". Las dos técnicas son más bien complementarias: Los métodos de hibridación están bien adaptados a evaluaciones de ultra-alta resolución y semicuantitativas en pequeñas secuencias, mientras que la electroforesis permanece incuestionable para alta resolución, para reproducibilidad y para el análisis de grandes moléculas o fragmentos. Otros sistemas, denominados "laboratorios en chips" o "sistemas microfluídicos", están también en desarrollo, y son prometedores de análisis más sencillos, más rentables y de mayor rendimiento en el análisis de ácidos nucleicos.

Si se conoce la posición de la mutación, se utiliza la mayoría de las veces la ampliación del cebador de un solo nucleótido, matrices de hibridación o PCR cuantitativa.

En la ampliación del cebador de un solo nucleótido, se realiza la reacción de secuenciado, en condiciones en las que la ampliación del cebador puede empezar solamente si una base dada (A, T, G o C) sigue al cebador. La misma reacción se lleva a cabo para cada base, y la detección de la ampliación se lleva a cabo mediante una electroforesis de secuenciado convencional.

En las matrices de hibridación, diferentes fragmentos de ADN "sonda" u oligonucleótidos que comprenden la mutación puntual, y que llevan todas las mutaciones esperadas, se disponen en una matriz sobre la superficie de un "chip", y se ponen en presencia del ácido nucleico diana para la prueba (ADN o ARN). En condiciones de hibridación adecuadas, es de esperar que la diana se hibride solamente con la sonda que lleva la frecuencia exactamente complementaria, identificando de este modo la secuencia de...

1. Método para analizar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en una cadena de ácidos nucleicos emparejados en forma de doble cadena que comprende por lo menos las etapas siguientes:

- poner en contacto en un medio líquido dicha doble cadena, susceptible de incluir por lo menos un emparejamiento erróneo, con por lo menos un compuesto que puede experimentar una interacción específica de emparejamiento de bases con dicho emparejamiento erróneo, utilizándose dicho(s) compuesto(s) en una concentración combinada de por lo menos 10 g/l en dicho medio y estando seleccionado de entre un oligonucléotido que tiene una longitud inferior a 5 nucleótidos, un nucleósido, una base o una mezcla de los mismos y,

- analizar dicho emparejamiento erróneo por un método analítico.

2. Método según la reivindicación 1, en el que las cadenas de ácidos nucleicos emparejadas en forma de doble cadena son dos cadenas de ADN que son total o parcialmente complementarias.

3. Método para llevar a cabo el análisis electroforético de doble cadena heterogénea "EHDA" en una muestra de ácido nucleico susceptible de incluir por lo menos una doble cadena heterogénea, comprendiendo dicho método por lo menos las etapas siguientes:

- poner en contacto en un medio líquido dicha muestra de ácido nucleico susceptible de incluir por lo menos una doble cadena heterogénea, con por lo menos un compuesto que puede experimentar una interacción específica de emparejamiento de bases con por lo menos un emparejamiento erróneo de dicha doble cadena heterogénea, siendo utilizados dicho(s) compuesto(s) a una concentración combinada de por lo menos 10 g/l de dicho medio y estando seleccionado de entre un oligonucléotido que tiene una longitud inferior a 5 nucleótidos, un nucleósido, una base o una mezcla de los mismos y,

- analizar la presencia de dicha doble cadena heterogénea gracias a su movilidad electroforética.

4. Método según la reivindicación 3, que comprende una etapa preliminar de desnaturalizar la muestra de ácido nucleico y renaturalizarla en condiciones convenientes para conseguir dobles cadenas tanto heterogéneas como homogéneas.

5. Método para analizar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en una cadena individual de ácido nucleico en un medio líquido que comprende por lo menos las etapas siguientes:

a) poner en contacto dicho ácido nucleico susceptible de incluir por lo menos una mutación con una sonda de ácido nucleico injertada en un soporte sólido,

b) permitir la hibridación de por lo menos una parte de dicha cadena de ácido nucleico con la sonda de ácido nucleico injertada,

c) lavar las cadenas no hibridadas, y

d) analizar dicha mutación por un método analítico,

en el que las etapas a) y/o c) se realizan en presencia de por lo menos un compuesto que puede experimentar una interacción específica de emparejamiento de bases con dicha mutación, estando dicho compuesto a una concentración de por lo menos 1 g/l y estando seleccionado de entre un oligonucléotido que tiene una longitud inferior a 5 nucleótidos, un nucleósido, una base o una mezcla de los mismos.

6. Método según las reivindicaciones 1 a 5, en el que la(s) cadena(s) de ácidos nucleicos es/son de ADN, ARN, ALN, APN monocatenario(s) o de cualquier análogo artificial o natural de ácidos nucleicos.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el compuesto que puede experimentar una interacción específica de emparejamiento de bases incluye por lo menos dos grupos adecuados para el enlace de hidrógeno, en una orientación, polaridad y espaciamiento compatibles con la creación de interacciones de atracción con por lo menos una de las "bases" A, T, G, C y U.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho compuesto no puede interferir con las reacciones de polimerización de nucleótidos ni incorporarse en una cadena de ADN recién polimerizada.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el oligonucleótido tiene una longitud inferior a 3 nucleótidos y preferentemente inferior a 2 nucleótidos.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto se selecciona de entre adenosina, guanosina, uridina, citidina, timidina y mezclas de los mismos.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el/los oligonucleótido(s) o nucleósido(s) en la mezcla de oligonucleótidos o nucleósidos no pueden experimentar mutuamente interacción de emparejamiento de bases.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el compuesto incluye citidina y timidina, o citidina y adenosina o guanosina y timidina o guanosina y adenosina.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en el que el/los compuesto(s) se utiliza(n) a una concentración de por lo menos 10 g/l.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el/los compuesto(s) se utiliza(n) a una concentración de por lo menos 25 g/l.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho(s) compuesto(s) presenta además por lo menos un sustituyente.

16. Método según la reivindicación 15, en el que dicho sustituyente provoca en dicho compuesto por lo menos uno de los cambios siguientes:

- aumento de solubilidad,

- cambio en la carga, o

- cambio en la fricción con un disolvente.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la mutación que se va a analizar es una mutación puntual.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 y 5 a 17, en el que dicha mutación se analiza por análisis de hibridación.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 6 a 17, en el que dicha mutación se analiza por análisis electroforético utilizando un medio líquido de separación.

20. Método según la reivindicación 19, el el que dicho medio líquido de separación contiene por lo menos un polímero a una concentración de por lo menos 1%, y preferentemente de por lo menos 3% en peso del peso total de dicho medio.

21. Método según la reivindicación 19 ó 20, en el que dicho medio líquido de separación contiene por lo menos un polímero seleccionado de entre el grupo constituido por poliacrilamidas N,N-disustituidas y poliacrilamidas N-sustituidas, en el que dichos N-sustituyentes se seleccionan de entre el grupo constituido por alquilo C₁ a C₁₂; alquilo C₁ a C₁₂ halo-sustituido; alquilo C₁ a C₁₂ metoxi-sustituido y alquilo C₁ a C₁₂ hidroxil-sustituido.

22. Método según la reivindicación 20 ó 21, en el que el medio líquido de separación contiene por lo menos un polímero compuesto de varios segmentos poliméricos, siendo dicho polímero del tipo copolímero de bloque irregular o del tipo polímero irregular en panal y que presenta de media por lo menos tres puntos de unión creados entre los segmentos del polímero de diferente naturaleza química o de configuración.

23. Método según la reivindicación 22, en el que el polímero comprende por lo menos un tipo de segmento de polímero que presenta, en el medio de separación, una afinidad específica por la pared del canal, y por lo menos un tipo de segmento de polímero que presenta en dicho medio menos o ninguna afinidad para la pared.

24. Método según la reivindicación 20 a 23, en el que dicho polímero contiene acrilamida o acrilamidas sustituidas.

25. Utilización de un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para diagnosticar una predisposición a enfermedades genéticas o cánceres asociados o supuestamente asociados a una mutación o mutaciones puntual(es) específica(s) o al diagnóstico o pronóstico de dichas enfermedades o cánceres.

26. Utilización según la reivindicación 25, en la que dicha enfermedad está asociada por lo menos a una mutación puntual en un gen con predisposición al cáncer de mama humano (BRCA).

27. Utilización de una composición que incluye por lo menos un compuesto que puede experimentar una interacción específica de emparejamiento de bases, estando presente dicho compuesto a una concentración de por lo menos 1 g/l y estando seleccionado de entre un oligonucléotido que tiene una longitud inferior a 5 nucleótidos, un nucleótido, una base o una mezcla de los mismos y, por lo menos un medio líquido de separación para analizar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en una cadena de ácidos nucleicos emparejados en forma de doble cadena.

28. Utilización según la reivindicación 27, en la que el compuesto es tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 16.

29. Utilización según la reivindicación 27 o la reivindicación 28, en la que dicho medio líquido de separación está definido en las reivindicaciones 20 a 24.

30. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en la que dicho medio líquido de separación incluye además por lo menos un compuesto seleccionado de entre:

- un polímero tamizador

- un polímero hidrófilo, y

- un polímero tensioactivo.

31. Utilización de una composición que incluye por lo menos un fragmento de ADN que tiene una secuencia nucleica relacionada con un gen en el que la mutación o mutaciones puntual(es) han estado asociadas o supuestamente asociadas a una enfermedad o a un aumento de la predisposición a una enfermedad, y por lo menos un compuesto que puede experimentar una interacción específica de emparejamiento de bases, utilizándose dicho(s) compuesto(s) a una concentración combinada de por lo menos 10 g/l y seleccionándose de entre un oligonucléotido que tiene una longitud inferior a 5 nucleótidos, un nucleótido, una base o una mezcla de los mismos para analizar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en una cadena de ácidos nucleicos emparejados en una forma de doble cadena.

32. Utilización de una composición que incluye por lo menos un compuesto que puede experimentar una interacción específica de emparejamiento de bases, estando presente dicho compuesto a una concentración de por lo menos 1 g/l y seleccionándose de entre un oligonucléotido que tiene una longitud inferior a 5 nucleótidos, un nucleósido, una base o una mezcla de los mismos, y un par de moléculas o grupos que actúan como una sonda de ADN denominada "baliza molecular" para analizar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en una cadena de ácidos nucleicos emparejados en una forma de doble cadena.

33. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, para llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

34. Método para analizar una mutación en un ácido nucleico que comprende por lo menos las etapas siguientes:

- realizar una reacción en cadena de la polimerasa en dicho ácido nucleico en presencia de por lo menos dos cebadores y una mezcla de compuestos que puede experimentar una interacción por emparejamiento de bases con nucleótidos o un análogo de los mismos, estando dichos compuestos presentes a una concentración combinada de por lo menos 10 g/l, seleccionándose de entre un oligonucléotido que tiene una longitud inferior a 5 nucleótidos, un nucleósido, una base o una mezcla de los mismos y, siendo incapaces de interferir con la reacción en cadena de la polimerasa y,

- analizar y/o cuantificar los fragmentos de ADN obtenidos de este modo.

35. Método según la reivindicación 33, en el que el compuesto es tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 16.