LACTOBACILUS DE UNA BACTERIOCINA ANTI-LISTERIA.

Cepa Lactobacillus sakei 2512 depositada en la Colección Nacional de los Cultivos de Microorganismos (CNCM) bajo el número I-2479

La presente invención se refiere a una bacteriocina de Lactobacillus sakei y más particularmente de Lactobacillus sakei 2512, a un secuencia nucleotídica que codifica esta bacteriocina, y a la utilización industrial de esta bacteriocina como agente activo contra floras patógenas o indeseables en la preparación de productos alimentarios.

Las bacterias lácticas se utilizan intensivamente en las fermentaciones alimentarias con el fin, no solamente de mejorar el sabor y la textura de los alimentos, sino sobre todo de prolongar su duración de conservación. Numerosas bacterias lácticas tienen en efecto la facultad de inhibir el crecimiento de ciertas bacterias gram-positivas, entres ellas las cepas patógenas como Listeria monocytogenes, gracias a la secreción de moléculas antagonistas, entre las cuales se encuentran unos compuestos peptídicos. Estos compuestos peptídicos, denominados bacteriocinas, presentan por lo tanto un potencial interesante para la conservación cualitativa y sanitaria de productos alimentarios fermentados.

A título representativo de estas bacteriocinas, se pueden citar principalmente las que forman la subclase de polipéptidos denominados bacteriocinas anti-Listeria, bacteriocinas de la clase IIa (Ennahar S. et al., 2000, FEMS Microbiol. Rev., 24:85-106) y cistibióticos (Jack R. et al., 1995, Microbiol. Rev., 59(2):171-200). Recientemente, se ha hecho constancia de la utilización potencial de una de estas bacteriocinas de la clase IIa, la divercina V41, para impedir el crecimiento de Listeria monocytogenes en el salmón ahumado (Duffes F. et al., 1999, J. Food Prot., 62(12):1394-1403).

Las secuencias de estos polipéptidos presentan fuertes similitudes en sus extremos N-terminales, en particular con la presencia de un puente disulfuro. El extremo C-terminal hidrófobo es mucho más variable, sin embargo algunas de estas bacteriocinas, denominadas de tipo pediocina (pediocina PA-1, enterocina A y divercina V41), se caracterizan por un tamaño superior a 40 residuos y la presencia de un segundo puente disulfuro en el extremo C-terminal.

Los autores de la presente invención han puesto de manifiesto una nueva bacteriocina de clase IIa producida a partir de una cepa específica de Lactobacillus sakei, que se ha revelado particularmente eficaz para inhibir el crecimiento de Listeria, más particularmente de Listeria monocytogenes.

De acuerdo con Tagg J.R, et al., Bacteriol. Rev., 40; 722-756 (1976), el término “Bacteriocina” en el sentido de la invención se refiere a un polipéptido producido mediante síntesis ribosómica a partir de microorganismos capaz de inhibir específicamente el crecimiento de otras bacterias.

La presente invención tiene por lo tanto como primer objeto un polipéptido que procede de la cepa lactobacillus sakei 2512, dotado de una actividad bacteriocinas.

La cepa Lactobacillus sakei 2512 ha sido depositada el 25 de mayo de 2000 en la Colección Nacional de los Cultivos de Microorganismos en la que que fue registrada con el número de depósito I-2479.

La bacteriocina objeto de la presente invención se denominó Sakacina G. Se trata de un polipéptido que posee una masa molecular del orden de 3700 a 3900 y preferiblemente de aproximadamente 3834 Da determinada par espectrometría de masas. Posee un espectro de inhibición bacteriana muy emparentado con el de las bacteriocinas de clase IIa. Es por esto por lo que se ha revelado particularmente eficaz contra las cepas de Lactobacillus sakei distintas de Lactobacillus sakei 2512, Pediococcus cerevisiae, el conjunto de cepas Listeria y contra los Enterococcus faecalis y durans. Por el contrario, se ha revelado inactiva contra otras especies de Lactobacillus como por ejemplo Lactobacillus debrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, y una cepa de Enterococcus faecium.

Igual que las bacteriocinas anti-Listeria de tipo pediocina, la sakacina G posee en su estructura peptídica ventajosamente dos puentes disulfuros.

Un análisis de los determinantes genéticos de varias bacteriocinas de clase IIa ha mostrado que los genes implicados en su producción, transporte e inmunidad están organizados en una o más estructuras de tipo operón. Estos operones tienen una localización frecuentemente plasmídica y poseen generalmente por lo menos dos genes que codifican unas proteínas, homologas a un vehículo de ABC y una proteína accesoria, probablemente implicada la exportación de bacteriocinas.

La clonación del fragmento nucleotídico que contiene el gen de la sakacina G ha revelado la existencia de tres marcos abiertos de lectura completos skgA1 (SEC ID n° 1), skgA2 (SEC ID n°3) y skgDc (SEC ID n° 13) (que incluye el cuadro de lectura truncado skgD (SEC ID n° 7)) y un cuadro truncado skgl (SEC ID n° 5) cuya representación esquemática está recogida en la figura 1. El fragmento nucleotídico es un doble hebra cuya monocadena 5'-3' está representada en la secuencia ID n°15.

Los productos de los genes skgA1 y skgA2, denominados pre-bacteriocinas, pueden sufrir una maduración en el curso de la cual sus péptidos líderes respectivos son escindidos entre les residuos 18 y 19, liberando así la sakacina G activa (residuos 19-55).

El fragmento nucleotídico monocatenario 5'-3' que comprende skgA1, skgA2, skgD y skgl figura en la SEC ID n°9.

La presente invención tiene por lo tanto asimismo por objeto un polipéptido aislado que corresponde a una bacteriocina, caracterizado porque comprende la secuencia ID n° 2 y/o la secuencia ID n° 4. La secuencia de la bacteriocina madura corresponde a la secuencia ID n°12 y está comprendida en las secuencias ID n°2 y ID n°4.

El marco de lectura denominado skgl codifica una proteína de 52 residuos. La comparación de esta secuencia con las de los bancos de datos muestra fuertes similitudes de Skgl con las proteínas denominada de inmunidad. Codifica aparentemente la proteína de inmunidad que protege la bacteria productora de la sakacina G.

La presente invención se extiende asimismo a un polipéptido aislado que comprende la secuencia ID n°6 que corresponde al marco de lectura skgl.

En lo que se refiere al último gen skgDc, este codifica una proteína que presenta una homología con proteínas de la familia de los vehículos de ABC, y más particularmente del vehículo de la pediocina PA-1. El gen skgDc codifica aparentemente el vehículo de ABC específico de la sakacina G.

La presente invención se extiende asimismo al polipéptido aislado que comprende la secuencia ID n° 8 que corresponde al gen denominado skgD y al polipéptido aislado que comprende la secuencia ID n°14 que corresponde al gen denominado skgDc.

Se entiende que están asimismo comprendidas las secuencias homólogas, definidas como:

i) las secuencias similares a al menos 70% de la secuencia SEC ID n°2, n°4, n°6, n°8, n°12 o n°14; o

ii) las secuencias codificadas por una secuencia de ácido nucleico homóloga, tal como se define a continuación, es decir, una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la secuencia SEC ID n° 1, n° 3, n° 5, n° 7, n° 9, n° 13 o n° 15 o su secuencia complementaria, en condiciones rigurosas de hibridación.

Más aún, el término "similares" se refiere a la perfecta semejanza o identidad entre los aminoácidos de las secuencias homólogas comparadas pero también a la semejanza no perfecta que se califica de similitud. Esta búsqueda de similitudes en una secuencia polipeptídica tiene en cuenta las sustituciones conservativas que son sustituciones de aminoácidos de la misma clase, tales como sustituciones de aminoácidos en las cadenas laterales no cargadas (tales como asparagina, glutamina, serina, treonina, y tirosina), de aminoácidos con cadenas laterales básicas (tales como lisina, arginina e histidina), de aminoácidos con cadenas laterales ácidas (tales como ácido aspártico y ácido glutámico); de aminoácidos con cadenas laterales apolares (tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y cisteína).

Más generalmente, mediante la expresión “secuencia de aminoácidos homóloga”, se entiende por lo tanto cualquier secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia SEC ID n° 2, n° 4, n° 6, n° 8, n° 12 o n° 14 por sustitución, deleción y/o inserción de un aminoácido o de un número reducido de aminoácidos, en particular por sustitución de aminoácidos...

Reivindicaciones

1. Cepa Lactobacillus sakei 2512 depositada en la Colección Nacional de los Cultivos de Microorganismos (CNCM) bajo el número I-2479.