HIDROLISIS ENZIMATICA SELECTIVA DE ESTERES TERC-BUTILICOS C TERMINAL DE PEPTIDOS.

Un proceso para la hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C terminales de sustratos peptídicos en la síntesis de péptidos,

que comprende hidrolizar uno o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres terc-butílicos C terminales usando la proteasa subtilisina en cualquier forma adecuada

Hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C terminal de péptidos.

La invención se refiere a un proceso de hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C terminales de sustratos peptídicos en la síntesis de péptidos.

En la síntesis de péptidos la selección apropiada de grupos protectores es muy importante. En la síntesis química de péptidos, el alargamiento del péptido en crecimiento habitualmente ocurre en la dirección N terminal para evitar la ramecización de los aminoácidos constituyentes. Para permitir el alargamiento gradual del péptido en crecimiento en dirección N terminal, el grupo protector de la función amino N terminal es de una naturaleza temporal. Este grupo se escinde selectivamente del péptido en cada ciclo de una síntesis peptídica sin afectar a los grupos protectores semipermanentes en las cadenas laterales funcionales y el extremo C. Los grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos constituyentes habitualmente están protegidos para evitar las reacciones secundarias.

En la síntesis química de péptidos, se puede seguir un enfoque completamente lineal o un enfoque convergente, es decir, un enfoque en el que el péptido final se ensambla a partir de fragmentos peptídicos protegidos. El último enfoque generalmente se prefiere para péptidos más largos, ya que los rendimientos globales son intrínsecamente más altos y se pueden preparar fragmentos paralelamente lo que da como resultado un tiempo de síntesis global más corto. En una síntesis convergente, todos los fragmentos excepto el fragmento C terminal se tienen que proteger en su extremo C con una función protectora que se puede escindir selectivamente. En el caso de síntesis peptídica en un soporte sólido, esta función habitualmente se proporciona por un asa en el propio soporte. Sin embargo, para la síntesis peptídica en una escala industrial se prefiere la síntesis en fase de solución por enzima de la síntesis en fase sólida. Particularmente se prefiere una síntesis de acuerdo con DioRaSSF¹®, un método en fase de solución que combina las ventajas de la fase sólida y el proceso en fase de solución clásico (documentos EP-A-1.291.356; US 6.864.357; Eggen I. et al., Org. Process Res. Dev. 2005, 9, 98-101; Eggen I. et al., J. Pept. Sci. 2005, 11.633-641).

El éster C terminal en una síntesis convergente debería ser estable en las condiciones del ensamblaje del péptido y más particularmente en las condiciones de desprotección del grupo protector N terminal temporal, que se repite en cada ciclo de una síntesis peptídica. Por otra parte, el grupo protector N terminal y los grupos protectores de las cadenas laterales necesitan permanecer sin afectarse cuando el éster en el extremo C se retira antes del propio acoplamiento de fragmento. Aunque se conoce una variedad de ésteres que se pueden usar para la protección del extremo C de los fragmentos peptídicos y están disponibles varias opciones para la desprotección química, ninguno de los métodos disponibles es generalmente aplicable. La mayoría de estos ésteres son de una naturaleza primaria, por ejemplo, ésteres metílicos, y por tanto, dan origen a formación de dicetopiperazina en la fase del dipéptido desprotegido. Adicionalmente, la introducción de la función éster con frecuencia requiere una activación relativamente fuerte de la función carboxílica que da como resultado la pérdida de la integridad enantiomérica del aminoácido esterificado. Finalmente, la función de éster con frecuencia se desbloquea en condiciones ácidas o básicas que conducen a modificaciones en el propio péptido. Basándose en su estabilidad elevada, su facilidad de introducción y su amplia disponibilidad comercial, se prefiere el éster terc-butílico si se puede conseguir la desprotección selectiva en presencia de grupos protectores de cadena lateral. Sin embargo, la desprotección química generalmente no es aplicable para este propósito.

Los métodos enzimáticos han ganado interés en la síntesis peptídica durante el último par de años. Las enzimas con frecuencia muestran selectividad química, de región y estereoselectividad elevada. Además, las enzimas habitualmente funcionan en condiciones muy suaves, a valores de pH neutros y a temperaturas de 20-50ºC. Por tanto, en tales condiciones, se pueden evitar las reacciones secundarias catalizadas por ácido o base.

En la técnica se conoce que algunos grupos protectores se pueden escindir por enzimas, que se pueden usar en el desbloqueo de péptidos. En particular se pueden aplicar ésteres, que se pueden hidrolizar mediante lipasas, esterasas y proteasas. Las lipasas y esterasas habitualmente se consideran más generalmente aplicables a química de grupos protectores en síntesis peptídica, ya que una desventaja de las proteasas es que las mismas también pueden hidrolizar los enlaces peptídicos (actividad endopeptidasa). Recientemente, se ha observado que determinadas lipasas y esterasas que portan el motivo de aminoácido GGG(A)X (donde G indica glicina y X cualquier aminoácido; en pocas enzimas una glicina se reemplaza por alanina, A) muestran remoción leve y selectiva de grupos protectores de éster terc-butílico en derivados de aminoácidos y compuestos relacionados. Se concluyó que en particular dos enzimas, BsubpNBE (p-nitrobenzil esterasa recombinante de Bacillus subtilis producida en E. coli) y CAL-A (lipasa A de Candida antarctica (Novozymes)) se pueden usar en química orgánica sintética para escindir ésteres terc-butílicos a partir de diversos sustratos (Schmidt M. et al., J. Org. Chem. 2005, 70, 3737-3740). Sin embargo, las actividades de esas enzimas no se han ensayado en ésteres terc-butílicos C terminales de péptidos, con la excepción de un dipéptido que no mostró ninguna actividad. La solubilidad de péptidos protegidos probablemente comportará un problema en los sistemas de disolvente que se han aplicado para ensayar las actividades enzimáticas, que usan en particular tolueno, n-hexano y éter dietílico como co-disolventes. Sin embargo, en general, los péptidos protegidos y especialmente los péptidos protegidos largos requieren disolventes orgánicos polares para disolverse (por ejemplo, DMF, NMP, diclorometano, metanol o acetonitrilo).

A pesar del hecho de que las proteasas son menos preferidas, el uso de una proteasa denominada termitasa se dice que ha dado como resultado la hidrólisis eficaz de ésteres peptídicos (Schultz M. et al., Synlett. 1992, 1,37-38). Sin embargo, la termitasa no ha encontrado un uso amplio en la síntesis peptídica desde el momento en el que se ha indicado esto. Entre otras razones, esto se puede deber a su disponibilidad comercial limitada (código de familia EC 3.4.21.66), que impide gravemente el cambio de escala a una escala industrial. Por tanto, todavía existe una necesidad de procesos enzimáticos aplicables de forma general para la remoción de ésteres C terminales, en particular, ésteres terc-butílicos, en química peptídica, especialmente para procesos a escala industrial.

Además, como una alternativa a la síntesis química de péptidos, existe un interés creciente en la síntesis enzimática de péptidos, en la que las etapas tanto de acoplamiento como de desprotección pueden estar mediadas por enzimas específicas. Debido a que las etapas de acoplamiento mediadas por enzimas no suscitan ramecización a diferencia de la alternativa química, el alargamiento del péptido en crecimiento en síntesis enzimática de péptidos puede ocurrir en dirección C terminal. Una síntesis de este tipo es, en efecto, una síntesis convergente en la que el fragmento C terminal se reemplaza por un derivado de aminoácido; por lo tanto, sería igualmente de beneficio a partir de la disponibilidad de procesos enzimáticos aplicables generalmente para la remoción de ésteres C terminales, en particular ésteres terc-butílicos.

Finalmente, la disponibilidad de procesos aplicables de forma general para la remoción de ésteres C terminales, en particular ésteres terc-butílicos, sería muy provechosa en la síntesis peptídica que comprende ciclaciones peptídicas que implican el extremo C del precursor lineal (es decir, ciclaciones de cabeza a cola y de cola a cadena lateral). Tales ciclaciones pueden tener lugar en solución, pero también en un soporte sólido cuando el precursor lineal está anclado a través de su extremo N o una cadena lateral.

Ahora se ha encontrado un nuevo proceso para la hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos...

1. Un proceso para la hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C terminales de sustratos peptídicos en la síntesis de péptidos, que comprende hidrolizar uno o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres terc-butílicos C terminales usando la proteasa subtilisina en cualquier forma adecuada.

2. El proceso de la reivindicación 1, en el que el sustrato peptídico que comprende el éster terc-butílico C terminal comprende un resto acilo C terminal que es un resto a-amino acilo de origen natural o sintético.

3. El proceso de la reivindicación 2, en el que el resto a-amino acilo se selecciona entre Ala, Cys protegida, Asp protegida, Glu protegida, Phe, Gly, His, Lys (protegida), Leu, Met, Asn, Gln, Arg (protegida), Ser (protegida), Thr, Val, Trp (protegida) y Tyr (protegida).

4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el sustrato peptídico es un di-, tri- o tetrapéptido.

5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sustrato peptídico se prepara mediante síntesis en fase de solución.

6. El proceso de la reivindicación 5, en el que el sustrato peptídico se prepara de acuerdo con un proceso para síntesis en solución rápida de un péptido en un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos, comprendiendo el proceso ciclos repetitivos de las etapas (a)-(d):

opcionalmente, (d) una etapa de desprotección separada, seguida por una o más extracciones acuosas,

por lo que en al menos un ciclo en la etapa b del proceso una amina que comprende un anión libre o un anión latente se usa como un eliminador de funciones carboxílicas activadas residuales.

7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteasa subtilisina es de la familia EC 3.4.21.62.

8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteasa subtilisina es subtilisina libre.

9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteasa subtilisina es subtilisina de agregado de enzima reticulado (CLEA).

10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la hidrólisis se realiza en una mezcla de un tampón acuoso y un disolvente orgánico.

11. El proceso de la reivindicación 10, en el que el disolvente orgánico es un disolvente polar.

12. El proceso de la reivindicación 11, en el que el disolvente orgánico se selecciona entre N,N-dimetilformamida (DMF), N-metil-2-pirrolidona (NMP), dioxano, N,N-dimetilacetamida (DMA), diclorometano (DCM), tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo y terc-butanol.

13. El proceso de la reivindicación 12, en el que el disolvente orgánico es DMF.

14. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el porcentaje del disolvente orgánico en la mezcla es del 50-60%.

15. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el pH al que se realiza la reacción se selecciona entre el intervalo de 6,5-10.

16. El proceso de la reivindicación 15, en el que el pH se selecciona entre intervalo de 6,5-8.

17. El proceso de la reivindicación 16, en el que el pH es 7.

18. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que la temperatura de reacción para la hidrólisis es 20-60ºC.

19. El proceso de la reivindicación 18, en el que la temperatura de reacción para la hidrólisis es 40ºC.

20. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que la cantidad de enzima varía del 1 al 50% p con relación al sustrato peptídico.

21. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en el que la hidrólisis se realiza gradualmente añadiendo porciones de la proteasa subtilisina en la mezcla de reacción que comprende uno o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres terc-butílicos C terminales.

22. Un proceso para la síntesis convergente de un péptido a partir de dos o más fragmentos peptídicos en el que al menos uno de los fragmentos peptídicos se prepara de acuerdo con un proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

23. Un proceso para la síntesis enzimática gradual de un péptido en dirección C terminal de acuerdo con un proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

24. Un proceso de síntesis peptídica que comprende ciclación peptídica que implica el extremo C del precursor lineal de acuerdo con un proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.