PROCESO PARA LA CONVERSIÓN DE ÉSTERES O ÁCIDOS PEPTÍDICOS C-TERMINALES EN AMIDAS EMPLEANDO SUBTILISINA EN PRESENCIA DE SALES DE AMONIO.

Un proceso para la amidación de ésteres o ácidos C-terminales de sustratos peptídicos,

en la síntesis en fase solución de péptidos, que comprende amidar uno o más sustratos peptídicos, que comprenden ésteres o ácidos Cterminales, usando la proteasa subtilisina en cualquier forma adecuada en presencia de una o más sales de amonio derivadas de un ácido que tiene un pKa por encima de 0

La invención se refiere a un proceso para la amidación enzimática selectiva de ésteres o ácidos C-terminales de sustratos peptídicos en la síntesis en fase solución de péptidos.

Muchos péptidos biológicamente activos contienen una función amida primaria C-terminal, por ejemplo, gonadorrelina, oxitocina y arginina vasopresina. Hay diversas estrategias para la síntesis de amidas peptídicas en solución, que pueden dividirse aproximadamente en cuatro categorías diferentes.

En el enfoque más sencillo, la síntesis se inicia a partir de la amino acil amida C-terminal libre, manteniendo la amida en su forma libre durante toda la síntesis. Aunque es el enfoque más obvio en un primer examen, la síntesis en solución en presencia de una función amida libre en la cadena peptídica en crecimiento a menudo está cargada de problemas de solubilidad graves, debido al enlace de hidrógeno. Además, para la síntesis peptídica a una escala de fabricación se prefiere particularmente el método DioRaSSP® (documentos EP-A-1.291.356; US 6.864.357; Eggen I. et al., Org. Process Res. Dev. 2005, 9, 98-101; Eggen I. et al., J. Peptide Sci., 2005, 11, 633-641). En este método, la cadena peptídica en crecimiento está más o menos anclada en una fase orgánica permanente. Sin embargo, cuando se usa una función amida libre, hay un riesgo significativo de perder una parte sustancial del péptido en crecimiento durante lavados acuosos, especialmente en los ciclos tempranos de la síntesis.

Para evitar los problemas de solubilidad mencionados anteriormente, la función amida puede protegerse durante la síntesis, empezando de esta manera a partir de la amino acil amida protegida C-terminalmente. Este enfoque asegura también el anclaje del péptido en crecimiento en la fase orgánica. Los grupos protectores para la función amida pueden seleccionarse entre bencilo (Wegand, F. et al., Chem. Ber., 1968, 101, 3623-3641), bencidrilo (Sakakibara, S. et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1967, 40, 2164-2167), trifenilmetilo (Sieber, P. et al., B., Tetrahedron Lett., 1991, 32, 739-742), xantenilo (Shimonishi, Y. Et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1962, 35, 1966-1970) y restos tipo ciclopropilmetilo (Carpino, L. A. et al., J. Org. Chem., 1995, 60, 7718-7719), cuya inestabilidad en ácidos se determina mediante los sustituyentes unidos a este resto. Un problema general es la mala accesibilidad y disponibilidad comercial de los derivados de aminoácido de partida, especialmente si estos contienen cadenas secundarias protegidas. Además, la escisión del grupo protector de la función amida, en condiciones ácidas, puede dar como resultado la formación de análogos alquilados, dependiendo de la secuencia real del péptido, las condiciones para la desprotección y la naturaleza del grupo protector.

Una tercera opción para la síntesis hacia péptidos con una función amida C-terminal es empezar a partir de amino acil ésteres, lo que permite una escisión selectiva hacia la función carboxílica libre en presencia de grupos protectores inestables en ácido de las cadenas secundarias del péptido. La función carboxílica libre se activa posteriormente para permitir la reacción con amoniaco, es decir, amonio. Los ésteres dentro del alcance de este enfoque incluyen 9-fluorofenilo (Fm) (Cunningham, B. R. et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35, 9517-9520) y 2-(4nitrofenilsulfonil)etilo (Nse) ésteres (Carreño, C. et al., J. Peptide res., 2000, 56, 63-69) que se escinden en condiciones básicas, ésteres de 2-(trimetilsilil)etilo (Tmse), que se escinden por fluoroyodolisis (Sieber, P., Helv. Chem. Acta, 1977, 60, 2711-2716) y ésteres de 2,4-dimetoxibencilo (Dmb) que se escinden por acidolisis moderada (McMurray, J. S., Tetrahedron Lett, 1991, 32, 7679-7682). El problema principal con este enfoque es que comprende dos etapas de inducción de racemización potenciales del derivado de aminoácido C-terminal, es decir, la etapa de esterificación y la etapa de amidación real. Además, la etapa de escisión puede conducir a reacciones secundarias dentro de la secuencia peptídico, tales como conversión de los restos Asp (OBut) internos de la succinimida en condiciones básicas (Mergler, M. et al., J. Pept. Sci., 2003, 9, 36-46) o fluoroyodolíticas. Finalmente, la propia función éster no puede ser completamente estable durante el ensamblaje de la secuencia peptídica; por ejemplo los ésteres de tipo bencilo (Fm y Dmb) se escinden durante la hidrogenolisis, descartando de esta manera el uso del grupo benciloxicarbonilo (Z) para la protección temporal de la función amino.

La última opción para la síntesis hacia péptidos con una función amida C-terminal es empezar a partir de ésteres de amino acilo primarios sencillos, tales como ésteres de metilo, etilo o bencilo, que en una etapa posterior se convierten en las amidas por amonolisis directa. Éstos están en general ampliamente disponibles y son compuestos de partida fácilmente accesibles. Sin embargo, este enfoque está limitado por el hecho de que las condiciones amonolíticas inducen también reacciones secundarias dentro de la secuencia peptídico, tales como racemización y conversión de los restos Asp(OBut) internos de la succinimida.

Puede concluirse que se prefiere el uso de ésteres de amino acilo primarios sencillos como los materiales de partida en la síntesis de péptidos con una función amida C-terminal, si la amonolisis química puede reemplazarse por un método selectivo moderado para la amidación.

Los métodos enzimáticos han ganado interés en la síntesis peptídica durante los dos pasados años. Las enzimas a menudo muestran una alta quimio-, regio-y esteroselectividad. Adicionalmente, las enzimas normalmente funcionan en condiciones muy moderadas, a valores de pH neutro y a temperaturas de 20-50ºC. De esta manera, en estas condiciones, pueden evitarse las reacciones secundarias.

En mamíferos se expresan diversas enzimas de amidación, incluyendo Monooxigenasa de α-Amidación de Peptidilglicina (PAM) bifuncional y las enzimas monofuncionales Monooxigenasa de α-Hidroxilación de Peptidilo (PHM) y Peptidil Amidoglicolato Liasa (PAL) (Kulathila, R. et al., Nat. Prod. Rep., 1999, 16, 145-154). Estas enzimas necesitan una glicina en el extremo C-terminal y, por lo tanto, no son aplicables genéricamente. Adicionalmente, estas enzimas aisladas son muy costosas y no han encontrado aplicación en el laboratorio (Čeřovský, V. et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 2001, 33, 183-187).

Čeřovský, V. et al. informaron (Čeřovský, V. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 1998, 37, 1885-1887) sobre la aplicación de una enzima aislada de la piel de naranja en la amidación del ácido libre de un péptido C-terminal. A pesar de la optimización los rendimientos nunca superaron el 35%. Adicionalmente, en otra publicación los rendimientos parecían depender en gran medida del sustrato usado (Čeřovský, V., Kula, M. R., Biotechnol. Appl. Biochem., 2001, 33, 183-187). Finalmente, el método de Čeřovský se basa en la conversión del péptido con un ácido C-terminal libre a la amida correspondiente. Puesto que la síntesis en fase solución normalmente produce un éster C-terminal, se requiere una etapa de síntesis adicional para desproteger la función éster. En consecuencia, será muy difícil aplicar esta enzima de piel de naranja en un proceso industrial.

El uso de lipasas ha demostrado una extensa aplicación en química orgánica. Varias publicaciones informan del uso de la lipasa Candida antartica en la amidación de compuestos orgánicos, dando como resultado amidas sustituidas y no sustituidas (Reyes-Duarte, D. et al., Biotech Lett., 2002, 24, 2057-2061; Sánchez. V. M. et al., J. Org. Chem. 1999, 64, 1464-1470; Torre, O. et al., Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 1007-1014; Maugard, T. et al., Tetrahedron, 1997, 53, 14, 5185-5194; Zoete de, M. C. et al., Sheldon, R. A. Journal Molecular Catalysis B: Enzymatic, 1996, 1, 109-113; Litjens, M. J. J. et al., Tetrahedron, 1999, 55, 12411-12418). Sin embargo, sigue sin informarse de la aplicación de esta enzima en la química peptídica.

Finalmente, Chen S-T et al., Synthesis, 1993, 858-860, informan de la amidación enzimática de ésteres de aminoácidos y ésteres peptídicos C-terminales con alcalasa (subtilisina libre) en presencia de cloruro de amonio/trietil amina, a un pH de 10,6 y mayor. Los rendimientos de los que se informa son entre el 50 y el 70%. Chen informa en una tabla de la amidación de un dipéptido con una conversión del 68% en 12 horas. Se informa también sobre la amidación del tripéptido. Sin embargo, la conversión no se indica. Puede... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para la amidación de ésteres o ácidos C-terminales de sustratos peptídicos, en la síntesis en fase solución de péptidos, que comprende amidar uno o más sustratos peptídicos, que comprenden ésteres o ácidos C-terminales, usando la proteasa subtilisina en cualquier forma adecuada en presencia de una o más sales de amonio derivadas de un ácido que tiene un pKa por encima de 0.

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los ésteres C-terminales de sustratos peptídicos están amidados.

3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los ésteres de los ésteres C-terminales del sustrato peptídico se seleccionan entre el grupo de ésteres de (ar)alquilo C1-12.

4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que los ésteres de los ésteres C-terminales del sustrato peptídico se seleccionan entre el grupo de ésteres de (ar)alquilo C1-12 primarios.

5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en el los en el que los ésteres de los ésteres C-terminales del sustrato peptídico se seleccionan entre el grupo de ésteres de alquilo C1-4 primarios.

6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en el éster del éster C-terminal del sustrato peptídico es el éster metílico C-terminal.

7. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sal de amonio se deriva de un ácido que tiene un pKa por encima de 3,5.

**(Ver fórmula)**

en la que

R1 se selecciona entre el grupo de hidrógeno, (ar)alquilo C1-12, arilo C6-12, -N(R2)2, -OH y R3-O-NH4+, R2 se selecciona entre el grupo de hidrógeno y/o alquilo C1-4 y, R3 es un enlace, un grupo carbonilo, o un grupo alquil C1-4 carbonilo, sustituido opcionalmente con uno o más grupos hidroxilo y/o -COO-NH4+.

opcionalmente en forma hidratada.

9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que R1 se selecciona entre el grupo de (ar)alquilo C1-12, arilo C6-12, -NH2, -OH y -O-NH4+.

10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la sal de amonio se selecciona entre carbamato de amonio, carbonato de amonio, bicarbonato de amonio, acetato de amonio, benzoato de amonio y mezclas de los mismos.

11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la sal de amonio es carbamato de amonio.

12. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proporción molar de sal de amonio a sustrato peptídico varía de 2:1 a 20:1.

13. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sustrato peptídico que comprende el éster o ácido C-terminal comprende un resto acilo C-terminal, que es un resto α-amino acilo de origen natural o sintético.

14. El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el resto α-amino acilo se selecciona entre Ala, Cys protegido, Asp protegido, Glu protegido, Phe, Gly, His, Lys (protegido), Leu, Met, Asn, Gln, Arg (protegido), Ser (protegido), Thr, Val, Trp (protegido) y Tyr (protegido).

15. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sustrato peptídico se prepara de acuerdo con un proceso para la síntesis en solución rápida de un péptido en un disolvente orgánico, o

una mezcla de disolventes orgánicos, comprendiendo el proceso ciclos repetitivos de las etapas (a)-(d):

a) una etapa de acoplamiento, usando un exceso de un componente carboxílico activado para acilar un componente amino, b) una etapa de inactivación en la que se usa un aceptor para retirar las funciones carboxílicos activadas residuales, en el que el aceptor puede usarse también para la desprotección del péptido en crecimiento, c) una o más extracciones acuosas y

opcionalmente, (d) una etapa de desprotección diferente, seguida de una o más extracciones acuosas, con lo que en al menos un ciclo en la etapa de proceso b se usa una amina que comprende un anión libre, o un anión latente, como aceptor de las funciones carboxílicas activadas residuales.

16. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteasa subtilisina es de la familia EC 3.4.21.62.

17. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteasa subtilisina es subtilisina libre.

18. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteasa subtilisina es un agregado de enzimas reticuladas (CLEA) de subtilisina.

19. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se usa un disolvente orgánico.

20. El proceso de la reivindicación 19, en el que el disolvente orgánico se selecciona entre N,N-dimetilformamida (DMF), N-metil-2-pirrolidona (NMP), dioxano, N,N-dimetilacetamida (DMA), diclorometano (DCM), tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo, terc-butanol, alcohol terc-amílico, dicloroetano (DCE), terc-butil metil éter (MTBE) y mezclas de los mismos.

21. El proceso de la reivindicación 20, en el que el disolvente orgánico es una mezcla de terc-butanol y DMF, tercbutanol y NMP, alcohol terc-amílico y DMF o alcohol terc-amílico y NMP.

22. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 19 a 21, en el que el agua está presente en el disolvente orgánico que varía del 0,0001 al 5% (v/v).

23. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pH al que se realiza la reacción se selecciona en el intervalo de 5,5-10.

24. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la temperatura de reacción para la amidación es 15-60ºC.

25. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de enzima varía del 1 al 50% en peso, relacionado con el sustrato peptídico.

26. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la amidación se realiza mediante la adición por etapas de porciones de la proteasa subtilisina (en cualquier forma adecuada) a la mezcla de reacción que comprende uno o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres o ácidos C-terminales.

27. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la amidación se realiza mediante la adición por etapas de porciones de la sal de amonio a la mezcla de reacción que comprende uno o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres o ácidos C-terminales.