IDENTIFICACION DE GENES DE LA 3-CETOESTEROIDE 9-ALFA-HIDROXILASA Y MICROORGANISMOS BLOQUEADOS DE LA ACTIVIDAD 3-CETOESTEROIDE 9-ALFA-HIDROXILASA.

Un método para construir una cepa genéticamente modificada de un microorganismo que degrada esteroides que carece de la capacidad de degradar el núcleo del esteroide,

comprendiendo el método la inactivación de los genes que codifican la actividad-KSH, el gen kshA de la SEC ID Nº:1 y/o el gen kshB de la SEC ID Nº 2

Identificación de genes de la 3-cetoesteroide 9a-hidroxilasa y microorganismos bloqueados en la actividad 3-cetoesteroide 9a-hidroxilasa.

La invención se refiere a secuencias polinucleotídicas aisladas que codifican componentes de la 3-cetoesteroide 9a-hidroxilasa, a microorganismos bloqueados en la actividad de la 3-cetoesteroide 9a-hidroxilasa, a un método para la preparación de dichos microorganismos, y al uso de tales microorganismos en ?¹-deshidrogenación de esteroides.

Hasta la fecha se dispone de un conocimiento muy limitado sobre la 3-cetoesteroide 9a-hidroxilasa (KSH), la enzima que realiza la 9a-hidroxilación de la 4-androsteno-3,17-diona (AD) y la 1,4 androstadieno-3,17-diona (ADD) en la degradación de esterol/esteroides microbiana. No se ha encontrado ninguna secuencia de nucleótidos de los genes que codifican los componentes de KSH. Además, surgen dificultades durante los procedimientos de purificación enzimática (Chang, F. N. et al. Biochemistry (1964) 3:1551-1557; Strijewski, A. Eur. J. Biochem. (1982) 128:125-135). Se ha purificado parcialmente una monooxigenasa de tres componentes con actividad KSH en Nocardia sp. M117 y se ha descubierto que constituye un sistema enzimático de tres componentes, compuesto por una flavoproteína reductasa y dos proteínas ferredoxinas (Strijewski, A. Eur. J. Biochem. (1982) 128:125-135). En Arthrobacter oxydans 317, la 9a-hidroxilación de la estructura de anillo policíclica esteroidea parecía portada por un plásmido (Dutta, R.K. et al. J. Basic Microbiol. (1992) 32:317-324). Sin embargo, no se presentó el análisis de la secuencia del plásmido.

La ausencia de datos genéticos ha obstaculizado la construcción de cepas mutantes definidas molecularmente con propiedades deseadas (es decir, bloqueo de la 9a-hidroxilación de esteroides) por la ingeniería genética. Se han aislado mutantes por mutagénesis clásica, pero estas cepas generalmente son inadecuadas en procesos industriales mayoritariamente debido a la inestabilidad genética y/o las bajas eficiencias de bioconversión. Los mutantes definidos molecularmente tienen ventajas comparados a los mutantes generados por mutagénesis clásica. Los mutantes construidos son genéticamente estables y las mutaciones introducidas son modificaciones genéticas bien conocidas. La construcción de cepas genéticamente modificadas hace obsoleto el uso extendido de agentes químicos para bloquear la 9a-hidroxilación (por ejemplo, a,a-dipiridil, o-fenantrolina). Los agentes químicos usados para bloquear la actividad KSH mayoritariamente no son específicos de reacción e inhiben otras importantes reacciones enzimáticas (por ejemplo, la 26-hidroxilación de esterol en la degradación de la cadena lateral de esterol), lo cual puede tener efectos negativos en la eficiencia de bioconversión de esterol. El uso de mutantes definidos por ingeniería genética soluciona estos problemas.

La 3-cetoesteroide 9a-hidroxilasa (KSH) es una enzima clave en la ruta de apertura del anillo B de esteroides microbianos. La KSH cataliza la conversión de AD en 9a-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona (9OHAD) y de ADD en el compuesto químicamente inestable [9OHADD]. Se ha encontrado actividad KSH en muchos géneros de bacterias (Martin, C.K.A. Adv. Appl. Microbiol. (1977) 22:29-58; Kieslich, K. J Basic Microbiol. (1985) 25: 461-474; Mahato, S.B. et al. Steroids (1997) 62: 332-345): por ejemplo Rhodococcus (Datceva, V. K. et al. Steroids (1989) 54: 271-286; van der Geize et al. FEMS Microbiol. Lett. (2001) 205; 197-202, Nocardia (Strijewski, A. Eur. J. Biochem. (1982) 128:125-135), Arthrobacter (Dutta, R. K. et al. J. Basic Microbiol. (1992) 32:317-324) y Mycobacterium (Wovcha, M. G. et al. Biochim. Biophys. Acta (1978) 531: 308-321). Las cepas de bacterias sin actividad KSH se consideran importantes en la biotransformación de esterol/esteroide. Los mutantes bloqueados en la actividad KSH podrán realizar sólo la reacción de la KSTD (3-cetoesteroide ?¹-deshidrogenasa, permitiendo de esta manera la ?¹-deshidrogenación selectiva de compuestos esteroideos. Son ejemplos la biotransformación de cortisol en prednisolona y la biotransformación de la AD en ADD. La bioconversión de esteroles por mutantes bloqueados a nivel de la 9a-hidroxilación de esteroides puede también conllevar una degradación selectiva de la cadena lateral de esterol, acumulándose de esta manera AD y/o ADD que son excelentes precursores para la síntesis de hormonas esteroideas bioactivas.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, ahora se proporcionan las secuencias polinucleotídicas aisladas de dos genes, designadas kshA y kshB de Rhodococcus erythropolis: SEC ID Nº:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente. La proteína kshA se codifica por los nucleótidos 499-1695 de SEC ID Nº:1 y la proteína kshB por los nucleótidos 387-1427 de SEC ID Nº:2. Así, en particular, se prefieren los polinucleótidos que comprenden las secuencias de ADN codificantes completas de los nucleótidos 499-1695 de la SEC ID Nº:1 y de los nucleótidos 387-1427 de SEC ID Nº:2, respectivamente.

Además, para acomodar la variabilidad de codones, la invención también incluye secuencias que codifican las mismas secuencias de aminoácidos de la proteína KshA y de la proteína KshB. También forman parte de la invención porciones de las secuencias codificantes que codifican dominios individuales de la proteína expresada, así como variaciones alélicas y de especie de las mismas. Algunas veces, un gen se expresa como una variante de corte y empalme, dando como resultado la inclusión de una secuencia de exón adicional, o la exclusión de un exón. También puede incluirse o excluirse una secuencia parcial de exón. Un gen puede también transcribirse desde cebadores alternativos que están localizados en diferentes posiciones dentro de un gen, dando como resultado transcritos con diferentes extremos 5'. La transcripción puede también terminar en diferentes sitios, dando como resultado diferentes extremos 3' del transcrito. Es de esperar que estas secuencias, así como las proteínas codificadas por estas secuencias, desarrollen funciones iguales o similares y formen también parte de la invención. La información de secuencia proporcionada aquí no debería ser tan estrechamente interpretada como para requerir la inclusión de bases identificadas erróneamente. La secuencia específica revelada aquí puede usarse fácilmente para aislar los genes completos que, as su vez, pueden someterse fácilmente a análisis de secuencia adicionales para identificar de esta manera errores de secuenciación.

La presente invención se refiere además a polinucleótidos que tienen ligeras variaciones o que tienen sitios polimórficos. Los polinucleótidos que tienen ligeras variaciones codifican polipéptidos que conservan la misma función o actividad biológica que la proteína madura natural.

El ADN de acuerdo con la invención puede obtenerse a partir de ADNc usando sondas adecuadas derivadas de la SEC ID Nº:1 o la SEC ID Nº:2. Alternativamente, la secuencia codificante podría ser ADN genómico, o prepararse usando técnicas de síntesis de ADN. El polinucleótido puede también estar en forma de ARN. Sí el polinucleótido es ADN, puede ser monocatenario o bicatenario. La cadena única podría ser la cadena codificante o la cadena no codificante (anti-sentido).

La presente invención se refiere además a polinucleótidos que tienen al menos el 70%, preferiblemente el 80%, más preferiblemente el 90%, incluso más preferiblemente el 95%, aún más preferiblemente el 98%, y todavía más preferiblemente al menos el 99% de identidad con la secuencia entera de ADN de los nucleótidos 499-1695 de SEC ID Nº:1 y de los nucleótidos 387-1427 de la SEC ID Nº:2, respectivamente. Tales polinucleótidos codifican polipéptidos que conservan la misma función biológica o actividad que la proteína madura natural. Alternativamente, también se incorporan en la invención fragmentos de los polinucleótidos arriba mencionados que codifican dominios de la proteína que todavía son capaces de unirse a sustratos.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse con programas tales como Clustal W 1.7 (Thompson J.D., et al. Nucleic Acids Res. (1994) 22:4673-4680: "CLUSTALW: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, position-specific gap penalties and weight matrix.") usado en los ajustes por defecto. El porcentaje de identidad generalmente se define por el número de restos idénticos entre las dos secuencias dividido...

1. Un método para construir una cepa genéticamente modificada de un microorganismo que degrada esteroides que carece de la capacidad de degradar el núcleo del esteroide, comprendiendo el método la inactivación de los genes que codifican la actividad-KSH, el gen kshA de la SEC ID Nº:1 y/o el gen kshB de la SEC ID Nº2.

2. El método de reivindicación 1, en el que la inactivación del gen o los genes se realiza por una deleción de genes dirigida y preferiblemente sin marcar.

3. Un microorganismo con la actividad 3-cetoesteroide 9a-hidroxilasa bloqueada caracterizado por que es un microorganismo genéticamente modificado, preferiblemente de la familia de los Actinomicetales, obtenible por el método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.

4. El microorganismo de la reivindicación 3, que es del género Rhodococcus.

5. El microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en el que también se inactiva al menos un gen que codifica la actividad 3-cetoesteroide ?^1-deshidrogenasa, preferiblemente por una deleción de genes sin marcar.

6. El microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, que se selecciona entre los microorganismos genéticamente modificados RG2, RG4 y RG9, DSM 14544, DSM 14545 y DSM 14546 respectivamente.

7. Un uso de los organismos genéticamente modificados de acuerdo con las reivindicaciones 3-6 en la ?¹-deshidrogenación de esteroides, preferiblemente en la preparación de 1,4-androstadieno-3,17-diona y prednisolona.