EXPRESION FAGICA MEDIANTE TRANSLOCACION COTRADUCCIONAL DE POLIPEPTIDOS DE FUSION.

Método de expresión en fago filamentoso, en el que se expresan en partículas fágicas polipéptidos de interés codificados por una biblioteca de ADN,

en el que dicha biblioteca de ADN es una biblioteca de ADNc o una biblioteca combinatorial de ADN que codifica una biblioteca de péptidos, un biblioteca de anticuerpos o una biblioteca basada en andamiajes alternativos, y en el que los polipéptidos de interés se translocan cotraduccionalmente a través de la membrana citoplasmática de bacterias Gram-negativas

Expresión fágica mediante translocación cotraduccional de polipéptidos de fusión.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo método de expresión fágica, a vectores fago o fagémido utilizados en el mismo y a las partículas fágicas obtenidas con el mismo.

Antecedentes de la invención

La expresión de polipéptidos sobre un bacteriófago (expresión fágica) es una técnica de selección que permite extraer polipéptidos con propiedades deseadas de entre una gran colección de variantes (Russel, M., Lowman, H.B. y Clackson, T., Introduction to phage biology and phage display, en: "Phage Display", Clackson, T. y Lowman, H.B., editores, Oxford University Press, 2004, páginas 1 a 26). La expresión fágica ha sido investigada intensivamente para la selección a partir de bibliotecas combinatoriales de anticuerpos o de péptidos.

Los bacteriófagos que claramente se han utilizado más ampliamente en la expresión fágica son los fagos filamentosos. Los fagos filamentosos constituyen una gran familia de virus bacterianos que infectan muchas bacterias Gram-negativas. Los fagos filamentosos mejor conocidos son aquellos que infectan a Escherichia coli; estos son f1/Ml3/f3 e IKe. Los fagos f1, M13 y fd son los que se han utilizado hasta el momento para la expresión en fagos filamentosos. Sus genomas son idénticos en más de 98% y sus productos génicos son intercambiables.

Un aspecto único del ensamblaje de los fagos filamentosos, en contraste con el ensamblaje de muchos otros bacteriófagos, es que es un proceso de secreción. La incorporación de polipéptidos de cubierta en el fago en crecimiento se produce en la membrana citoplasmática y los fagos nacientes son extruidos de la célula a medida que se ensamblan (Russel et al., loc. cit.). La célula de E. coli no se lisa durante este proceso. Las cinco proteínas de la cubierta vírica (pIII, pVI, pVII, pVIII y pIX) se insertan en la membrana citoplasmática antes de su incorporación en las partículas fágicas (figura 1). Por ejemplo, la mayor parte de pIII se transloca a través de la membrana hasta el periplasma, mientras que su cola hidrofóbica C-terminal ancla la proteína en la membrana.

Un requisito para la expresión en fago filamentoso es la translocación del polipéptido de interés (PDI) a través de la membrana citoplasmática. Esto se consigue normalmente fusionando genéticamente el PDI con una proteína de la cubierta fágica y translocando el polipéptido de fusión correspondiente. Alternativamente, el PDI y la proteína de cubierta fágica se translocan independientemente.

En esta situación, el PDI se liga establemente a la partícula fágica en el periplasma mediante, por ejemplo, la formación de un enlace disulfuro (expresión Cys) o la formación de una cremallera de leucinas (sistema pJuFo) con una proteína de cubierta fágica correspondiente. En la expresión convencional en fago filamentoso con fusiones a pIII, se utiliza la ruta Sec para la translocación del polipéptido de fusión que comprende el PDI. En esta ruta, en primer lugar se sintetiza el polipéptido en el ribosoma y después resulta translocado post-traduccionalmente, en estado no plegado, por el translocón Sec (figura 2, (3)-(4)-(5)). Es decir, la translocación a través de la membrana citoplasmática se inicia únicamente tras la síntesis de una cantidad sustancial de la cadena polipeptídica. Sin embargo, la contribución del mecanismo de translocación al éxito de la expresión fágica no ha sido aclarada por completo, y en la técnica anterior no se ha explorado la posibilidad de utilizar una ruta de translocación post-traduccional.

Las proteínas intracelulares y extracelulares de un amplio abanico de tamaños y estructuras han sido expresadas funcionalmente sobre un fago filamentoso (Russel et al., loc. cit.). Sin embargo, algunos polipéptidos son recalcitrantes a la expresión debido a sus propiedades individuales, en gran parte por motivos desconocidos. Esto provoca que el éxito de la expresión de una proteína determinada resulte impredecible. De esta manera, habitualmente se ha recomendado someter a ensayo en primer lugar la eficiencia de expresión sobre el fago filamentoso para cada proteína que deba utilizarse. Además, al crear una biblioteca combinatorial para la expresión fágica, no todos los clones se expresan con una eficiencia similar; esto resulta especialmente cierto para las bibliotecas generadas a partir de ADNcs. Los problemas de expresión de los polipéptidos pueden ser el resultado de la interferencia de los mismos con la producción del fago, su agregación periplasmática, su proteolisis, su toxicidad para E. coli o su incompatibilidad con la ruta de translocación utilizada. Especialmente, la etapa anterior a la translocación es un factor importante que influye sobre la incorporación de los polipéptidos de fusión a las partículas fágicas. En el caso de que los polipéptidos se plieguen prematuramente, pueden ser refractarios a la translocación o incluso mostrar toxicidad citoplasmática. De esta manera, resulta importante que la proteína se transloque post-traduccionalmente (potencialmente permitiendo el plegamiento prematuro) o cotraduccionalmente (no permitiendo el plegamiento citoplasmático). Los métodos de expresión en fago filamentoso actuales utilizan rutas post-traduccionales para la translocación del polipéptido de fusión a través de la membrana citoplasmática (Russel et al., loc. cit.; Paschke, M. y Höhne, W., Gene 350:79-88, 2005). De esta manera, los polipéptidos incompatibles con dichas rutas resultarán refractarios a la expresión, provocando que las selecciones mediante expresión fágica sean muy ineficientes o incluso imposibles. Por ejemplo, la ruta post-traduccional Sec, que se utiliza prácticamente en exclusiva en la expresión fágica, es inherentemente incapaz de translocar proteínas que no pueden permanecer en un estado no plegado en el citoplasma, debido a que el translocón Sec mismo únicamente puede transportar polipéptidos no plegados (Huber, D., Boyd, D., Xia, Y., Olma, M.H., Gerstein, M. y Beckwith, J., J. Bacteriol. 187:2983-2991, 2005; Paschke et al., loc. cit.).

Rosander, A., Frykberg, L., Ausmess, N. y Müller, P., Molecular Plant-Microbe Interactions 16:727-737, 2003, dan a conocer el atrapamiento de secuencias de señal de proteínas exportadas de la bacteria Gram-negativa Bradyrhizobium japonicum. Los autores utilizan un método de expresión fágica en el que la proteína de cubierta carece de una secuencia de señal y por lo tanto depende del fragmento insertado procedente de la biblioteca de ADN preparada mediante fragmentación aleatoria de ADN cromosómico codificante de secuencias de señal, para la exportación con éxito.

Rosander, A., Bjerketorp, J., Frykberg, L. y Jacobsson, K., J. of Microbial Methods 51:43-55, 2002, informan de un método de expresión fágica que puede utilizarse como un nuevo método de cribado para identificar proteínas extracelulares. Los autores utilizan un vector fagémido que carece de las secuencias de señal que normalmente orientan la proteína de fusión codificada a la membrana celular de E. coli. El ADN cromosómico fragmentado de S. aureus proporciona las secuencias de señal necesarias y permite la identificación de diversas proteínas secretadas y proteínas transmembranales.

Lee, H.C. y Bernstein, H.D., Proceedings of National Academy of Science U.S.A. 98:3471-3476, 2001, informan de que las proteínas membranales generalmente son exportadas a través de la ruta SRP.

Jestin, J.-L., Volioti, G. y Winter, G., Research in Microbiology 152:187-191, 2001, describen una expresión mejorada de una proteína (fragmento Stoffel de polimerasa Taq fusionada con la proteína p3 del fago) en un fago filamentoso, basada en la aleatorización de una secuencia de señal pelB y una secuencia situada a menos de 100 nucleótidos cadena arriba del sitio de corte de peptidasa de señal que es conocido que influye positivamente sobre la regulación traduccional y la translocación.

De esta manera, el problema técnico subyacente a la presente invención es la identificación de nuevos enfoques de translocación para la expresión eficiente de dichos polipéptidos en fagos filamentosos que se expresan ineficientemente mediante la utilización de la translocación post-traduccional. La solución a este problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere...

1. Método de expresión en fago filamentoso, en el que se expresan en partículas fágicas polipéptidos de interés codificados por una biblioteca de ADN, en el que dicha biblioteca de ADN es una biblioteca de ADNc o una biblioteca combinatorial de ADN que codifica una biblioteca de péptidos, un biblioteca de anticuerpos o una biblioteca basada en andamiajes alternativos, y en el que los polipéptidos de interés se translocan cotraduccionalmente a través de la membrana citoplasmática de bacterias Gram-negativas.

2. Método según la reivindicación 2, en el que la translocación cotraduccional se lleva a cabo basándose en la ruta de la partícula de reconocimiento de señal.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de señal utilizada para la translocación del polipéptido de interés que debe expresarse en la partícula fágica es una secuencia de señal que estimula la translocación cotraduccional de TrxA.

4. Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que la secuencia de señal utilizada para la translocación de los polipéptidos de interés que deben expresarse en la partícula fágica se seleccionan de entre el grupo que consiste de secuencias de señal de TorT, SfmC, FocC, CcmH, YraI, TolB, NikA, FlgI y DsbA, y secuencias de aminoácidos con una identidad de 70% respecto a una de dichas secuencias de señal, en el que dichas secuencias de aminoácidos conservan la carga total, la hidrofobicidad y las propiedades de corte de las regiones n, h y c de dicha secuencia de señal, respectivamente.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la secuencia de señal utilizada para la translocación de los polipéptidos de interés que deben expresarse en las partículas fágicas se selecciona de entre el grupo que consiste de secuencias de señal de TorT, SfmC, TolB y DsbA.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los polipéptidos de interés que deben expresarse en las partículas fágicas son proteínas repetitivas.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas siguientes:

(a) construir un vector fago filamentoso o fagémido que contiene un casete de expresión para un polipéptido de fusión que presenta una secuencia de señal N-terminal que estimula la translocación cotraduccional del polipéptido de fusión a través de la membrana citoplasmática de las bacterias Gram-negativas,

(b) construir una biblioteca combinatorial de vectores fágicos o fagémidos mediante la clonación de la biblioteca de ADN codificante de los polipéptidos de interés en el casete de expresión del vector de la etapa (a),

(c) transformar bacterias Gram-negativas adecuadas con la biblioteca de vectores de la etapa (b), y (d) llevar a cabo ciclos de selección de expresión fágica para separar las partículas fágicas basándose en las propiedades de los polipéptidos de interés expresados.

8. Método de expresión en fago filamentoso, en el que un polipéptido de interés expresado en la partícula fágica se transloca cotraduccionalmente a través de la membrana citoplasmática de bacterias Gram-negativas utilizando una secuencia de señal seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias de señal de TorT, SfmC, FocC, CcmH, YraI, TolB, NikA, FlgI y DsbA, y secuencias de aminoácidos con una identidad de 70% respecto a una de dichas secuencias de señal, en el que dichas secuencias de aminoácidos conservan la carga total, la hidrofobicidad y las propiedades de corte de las regiones n, h y c de dicha secuencia de señal, respectivamente.

9. Método según la reivindicación 8, en el que la secuencia de señal se selecciona de entre el grupo que consiste de secuencias de señal de TorT, SfmC, TolB y DsbA.

10. Vector fágico o fagémido adecuado para el método según la reivindicación 1, que comprende un constructo génico codificante de una proteína de fusión que comprende el polipéptido de interés que debe expresarse en la partícula fágica y una secuencia de señal seleccionada de entre el grupo que consiste de secuencias de señal de TorT, SfmC, FocC, CcmH, YraI, TolB, NikA, FlgI y DsbA, y secuencias de aminoácidos con un 70% de identidad respecto a dichas secuencias de señal, en el que dichas secuencias de aminoácidos conservan la carga total, la hidrofobicidad y las propiedades de corte de las regiones n, h y c de dicha secuencia de señal, respectivamente.

11. Vector según la reivindicación 10, en el que la secuencia de señal se selecciona de entre el grupo que consiste de secuencias de señal de TorT, SfmC, TolB y DsbA.

12. Biblioteca de vectores fágicos o fagémidos que comprende constructos génicos codificantes de proteínas de fusión, en la que cada una de las proteínas de fusión comprende una secuencia de señal que estimula la translocación cotraduccional de TrxA y un polipéptido de interés que debe expresarse en una partícula fágica, en la que cada polipéptido de interés se encuentra codificado por un miembro de una biblioteca de ADN, en la que dicha biblioteca de ADN es una biblioteca de ADNc o una biblioteca combinatorial de ADN que codifica una biblioteca de péptidos, una biblioteca de anticuerpos o una biblioteca basada en andamiajes alternativos.

13. Biblioteca de vectores según la reivindicación 12, en la que la secuencia de señal se selecciona de entre el grupo que consiste de las secuencias de señal de TorT, SfmC, FocC, CcmH, YraI, TolB, NikA, FlgI y DsbA, y secuencias de aminoácidos con una identidad de 70% respecto a una de dichas secuencias de señal, en la que dichas secuencias de aminoácidos conservan la carga total, la hidrofobicidad y las propiedades de corte de las regiones n, h y c de dicha secuencia de señal, respectivamente.

14. Biblioteca de vectores según la reivindicación 12, en la que la secuencia de señal se selecciona de entre el grupo que consiste de las secuencias de señal de TorT, SfmC, TolB y DsbA.

15. Biblioteca de vectores según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en la que la biblioteca de ADN codificante de los polipéptidos de interés es una biblioteca de ADN codificante de proteínas repetitivas.