Estudio de informatividad genética.

La presente invención se refiere al uso de gametos únicos para la realización de estudios de informatividad genética,

especialmente en aquellos casos donde la alteración genética ocurre de novo en una familia o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores de miembros de la misma familia

Estudio de informatividad genética.

La presente invención se engloba dentro del área de ciencias de la salud, dentro del sector de aplicación de Medicina Reproductiva, Genética y Biología Molecular, principalmente.

Estado de la técnica anterior

El Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) es una novedosa técnica al servicio de la Medicina Reproductiva que permite la selección de embriones provenientes de ciclos de reproducción asistida libres de una determinada anomalía genética o cromosómica, antes de ser transferidos al útero materno. Actualmente, es una de las principales vías de innovación e investigación.

El DGP se ofrece a parejas portadoras o afectas de una determinada enfermedad genética o cromosomopatía, ya que se enfrentan a un importante riesgo reproductivo pudiendo elegir entre diferentes opciones: (a) diagnóstico prenatal, (b) donación de gametos, (c) adopción o (d) no tener descendencia. El DGP es una alternativa al diagnóstico prenatal evitando que la pareja tenga que someterse a una interrupción del embarazo en caso de que el feto se encuentre afecto.

La primera aplicación fue realizada por A. Handyside en 1990 consiguiendo la selección de embriones libres de una enfermedad genética ligada a los cromosomas sexuales. En la actualidad, el DGP permite el diagnóstico de cromosomopatías incluyendo el cribado de aneuploidías cromosómicas, el sexado en parejas portadoras de enfermedades ligadas a los cromosomas sexuales y anomalías cromosómicas estructurales, empleando la hibridación in situ fluorescente (FISH). En combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se puede realizar el diagnóstico de enfermedades monogénicas. De modo que se diferencian en el DGP dos grandes bloques, desde el punto de vista de la metodología diagnóstica y del nivel de estudio: anomalías cromosómicas y enfermedades monogénicas.

La limitación principal del DGP de enfermedades monogénicas es la cantidad de DNA disponible para realizar el diagnóstico, ya que disponemos de una única célula para realizar el estudio. Los métodos empleados deben ser altamente sensibles y eficaces, a la vez que rápidos, extremando al máximo las medidas encaminadas a prevenir la contaminación. Entre los métodos empleados para el DGP de las enfermedades monogénicas, los fragmentos amplificados mediante PCR se pueden analizar por: digestión con enzimas de restricción, secuenciación y análisis de polimorfismos.

Los diagnósticos que dependen de la amplificación del ADN mediante PCR están sujetos a una serie de problemas, tales como:

- "allele dropout" (ADO) fenómeno que ocurre cuando solamente uno de los dos alelos presentes es amplificado, provocando errores de diagnóstico en embriones heterocigotos.

- Contaminación con ADN exógeno debido al gran número de ciclos de PCR necesarios para la amplificación de un único genoma y a la posibilidad de contaminación con células del cúmulo materno o de espermatozoides. De ahí la necesidad de testar rigurosamente los reactivos utilizados para la PCR, así como liberar completamente el embrión de células del cúmulo y utilizar la inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) como técnica de fertilización.

- Reducida o limitada eficacia de amplificación.

La utilización de polimorfismos ligados a los genes objeto del diagnóstico es la estrategia más eficaz y segura al evitar los posibles errores debido al ADO, al tiempo que permite detectar los posibles casos de contaminación con ADN exógeno, que también podrían producir errores de interpretación y por tanto diagnósticos erróneos. Para incrementar la sensibilidad del diagnóstico se incluye más de un polimorfismo. Generalmente, se emplean dos polimorfismos que flanquean el gen o la mutación responsable de la enfermedad, la combinación de los mismos conforman el haplotipo asociado o ligado a la enfermedad.

El primer paso previo a cualquier DGP de enfermedades monogénicas es el estudio genético del caso índice. A partir del cual se debe realizar un estudio de informatividad familiar con el que poder conocer cuales son los polimorfismos asociados a la enfermedad. Para ello, debe existir algún otro miembro de la familia vivo, afecto o portador, y así comparando miembros sanos y afectos poder establecer cual es el haplotipo de riesgo en esa familia.

En casos en los que la mutación responsable de la enfermedad genética ha ocurrido de de novo en una familia, es decir, sólo hay un miembro afecto vivo o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores, el estudio de polimorfismos o segregación, a pesar de ser la mejor estrategia para el DGP no puede ser utilizada.

Otro grupo de candidatos en los que se contempla la posibilidad de llevar a cabo un DGP son aquellas parejas en la que uno de sus miembros es portador de una anomalía cromosómica. Usualmente, suelen ser portadores de anomalías cromosómicas estructurales (translocaciones, grandes inversiones) aunque también serían candidatos potenciales aquellos individuos que presentan mosaicismo para anomalías cromosómicas numéricas (mosaicos para el Síndrome de Klinefelter, mosaicos 47, XYY, etc.). Una reorganización cromosómica conlleva la producción de una cierta proporción de gametos desequilibrados y por lo tanto a la obtención de embriones cromosomicamente anormales. La probabilidad de obtener embriones cromosomicamente equilibrados, desequilibrados pero viables (y por lo tanto de posibles descendientes afectos de síndromes debidos a anomalías cromosómicas) o cromosomicamente desequilibrados no viables (que suelen cursar en abortos de primer trimestre) dependerá de cada reorganización concreta.

Los portadores de anomalías cromosómicas también suelen ser pacientes fenotipicamente normales. No obstante, en su mayoría, conocen su riesgo reproductivo ya que es frecuente que la reorganización cromosómica de que son portadores tenga un origen familiar. Por otra parte, no es de extrañar que sean parejas que consultan por infertilidad debido a su dificultad para conseguir un embarazo o para obtener gestaciones evolutivas. La posibilidad de llevar a cabo un DGP en estos pacientes dependerá de cada reorganización cromosómica en concreto.

A lo largo de los últimos años el DGP ha aumentado ampliamente su espectro de aplicación. Otros candidatos y posibilidades diagnósticas que algunos grupos incluyen en sus programas de DGP son: pacientes con edad reproductiva avanzada, en las cuales de sugiere una selección embrionaria a través de un estudio cromosómico con el objetivo de mejorar las tasas de implantación en este grupo y reducir su riesgo de transmisión de cromosomopatías a la descendencia; pacientes provenientes de ICSI (Inyección Citoplasmática de Espermatozoides) por factor masculino severo en los cuales se ha detectado un incremento significativo de anomalías cromosómicas en los espermatozoides; pacientes con fallos repetidos de FIV implantación en los que se sospecha de posibles anomalías cromosómicas como las causantes de los resultados negativos obtenidos; pacientes en los que se sospecha de la existencia de un mosaicismo gonadal e individuos de riesgo para la transmisión de carcinomas hereditarios.

La primera limitación técnica que impone el diagnóstico preimplantacional es la fuente de embriones ya que las parejas candidatas a un DGP deben someterse a una FIV con los consiguientes tratamientos, desventajas y limitaciones que el procedimiento implica. Así pues, la tasa de éxito de la FIV, estimada en un 50% de forma global, representa también una importante limitación para el DGP.

Por otra parte, no debemos olvidar que el número y la calidad de los embriones obtenidos condicionarán el éxito de un diagnóstico preimplantacional.

Una limitación importante de la aplicación de DGP a partir de embriones se debe al estadio embrionario en el cual se practica la biopsia, ya que ha de permitir la retirada de uno o dos blastómeros sin que afecte a la viabilidad del embrión. Por otra parte, hemos de disponer de tiempo suficiente para llevar a cabo del estudio genético y la transferencia en el mismo ciclo evitando, dentro de lo posible, la congelación de los embriones biopsiados.

La identificación del haplotipo de riesgo de una determinada enfermedad monogénica se puede establecer empleando el ADN obtenido a partir de linfocitos de sangre periférica. Como resultado de la amplificación por PCR se obtienen dos alelos por cada polimorfismo en caso de que se trate de un individuo heterocigoto y un único...

1. Uso de gametos únicos individualizados para llevar a cabo estudios de informatividad genética.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación anterior 1, caracterizado porque el estudio de informatividad genética se emplea para la identificación del haplotipo de riesgo de una determinada enfermedad monogénica.

3. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque el estudio de informatividad genética se emplea para el propósito de diagnóstico genético preimplantacional.

4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, caracterizado porque se emplea en aquellos casos en los que la mutación responsable de la enfermedad genética ha ocurrido de novo en una familia o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores.

5. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, caracterizado porque el material biológico de partida para la obtención de los gametos únicos individualizados se selecciona entre una muestra seminal, ovocitos y corpúsculo polar de ovocitos maduros.

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, caracterizado porque el gameto único individualizado es un espermatozoide.

7. Método de estudio de informatividad genética caracterizado porque comprende la amplificación del ADN de gametos únicos individualizados mediante amplificación genómica por desplazamiento múltiple.

8. El método de acuerdo con la reivindicación anterior 7, caracterizado porque la amplificación genómica por desplazamiento múltiple se lleva a cabo usando la ADN polimerasa del bacteriofago phi29.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 7 a 8, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) aislar un único gameto de una muestra;

b) poner en contacto el gameto único individualizado con un tampón de lisis alcalino;

c) neutralizar la lisis alcalina; y

d) realizar la amplificación con la ADN polimerasa del bacteriófago phi29.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 7 a 9, caracterizado porque el gameto único individualizado es un espermatozoide.