Procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra,

que comprende las etapas siguientes:

(a) proporcionar una diversidad de alícuota(s) de la muestra, en la que cada alícuota comprende ácido nucleico en una cantidad que es inferior a un genoma por alícuota;

(b) ampliar una o más secuencias de ácido nucleico en cada alícuota(s) en una primera reacción de amplificación;

(c) subdividir uno o más de los productos empleados en alícuotas de la réplica y llevar a cabo una segunda reacción de amplificación para una o más secuencias de ácido nucleico en cada alícuota(s), en la que cada una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de prueba y por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de referencia;

(d) calcular el número de copias por comparación en cada una de las alícuotas de la réplica del número de productos amplificados obtenido en el marcador de prueba con el número de productos amplificados obtenidos para el marcador de referencia

Procedimiento para determinar el número de copias.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de cambios en el número de copias de secuencias de ácido nucleico (tales como el ADN genómico) y varias aplicaciones de este procedimiento. A título de ejemplo, el procedimiento puede utilizarse para la detección de alteraciones genómicas y el diagnóstico de enfermedades, tal como el cáncer. Además, se describe asimismo una transposición no recíproca t(3;5) identificada por el procedimiento de la presente invención.

Antecedentes de la invención

Las alteraciones cromosómicas (por ejemplo anomalías) están asociadas con frecuencia a trastornos genéticos, enfermedades degenerativas y cáncer. La deleción o multiplicación de copias de cromosomas completos y la deleción o las amplificaciones de segmentos cromosómicos o de zonas específicas son sucesos frecuentes en la enfermedad, tal como el cáncer (Breast Cancer Res. Treat. 18: Supl. 1:5-14; Biochim. Biophys. Acta. 1072:33-50). De hecho, las amplificaciones y deleciones de la secuencia de ADN pueden ser causa de enfermedad. Por ejemplo, los protooncogenes y los genes supresores del tumor, respectivamente, son con frecuencia característicos de la tumorigénesis (Cancer Genet. Cytogenet. 49:203-217). Evidentemente, la identificación y clonación de zonas genómicas específicas asociadas a la enfermedad es crucial tanto para el estudio de la enfermedad como para el desarrollo de mejores medios de diagnóstico y pronóstico.

Los procedimientos para determinar el estado de los genomas individuales se requieren después del periodo de secuenciado del genoma para llevar a cabo los objetivos de la medicina personalizada, preventiva y de diagnóstico. Los genomas afectados (por ejemplo de cáncer) presentan muchas anomalías aunque las anomalías cromosómicas hereditarias están asociadas a muchos síndromes complejos y predisposiciones a enfermedades. Realmente, el secuenciado propuesto de una gama de genomas completos de cáncer debe enfocarse mejor en aquellas regiones en las que están situadas las aberraciones, utilizando procedimientos de exploración de genomas para dichos cambios. Los neoplasmas con frecuencia presentan aberraciones citogenéticas complejas que incluyen deleciones, amplificaciones y transposiciones. Aunque las leucemias y los sarcomas por lo general presentan transposiciones cromosómicas recíprocas (2), los tumores epiteliales (que comprenden más del 90% de los cánceres humanos) son mucho más heterogéneos (1). Los episodios principales en los tumores epiteliales son la ganancia o pérdida de cromosomas y las transposiciones desequilibradas. Además de esto, existen pequeñas anomalías citogenéticamente invisibles en tumores, por ejemplo las encontrados a veces en asociación con transposiciones cromosómicas (3). Particularmente bien caracterizadas, las transposiciones cromosómicas no recíprocas son las der3 t(3;5) desequilibradas en el adenocarcinoma renal (4,5). Estas anomalías se asocian específicamente al adenocarcinoma renal no papilar, en el que se produce a una frecuencia de por lo menos el 15% (6). La aclaración de los puntos de inflexión der(3)t(3;5) de estas transposiciones ha sido obstaculizada porque no son recíprocas.

Un enfoque a este problema podría estar basado en el hecho de que las transposiciones no recíprocas producen un cambio en el número de copias de las secuencias genómicas. Están disponibles numerosas técnicas basadas en la hibridación para explorar el número de copias en los genomas. Estos procedimientos utilizan ADN genómico (7) como sonda para las matrices de BACS o PACS (8, 9) u oligonucleótidos (10, 11) que representan la secuencia de referencia humana o utilizan sondas genómicas de representación (ROMA) (12-14) o matrices de SNP (15). Los procedimientos basados en la matriz, sin embargo, carecen de flexibilidad ya que debe crearse una nueva matriz para cada conjunto de dianas que van a examinarse. Además, estos procedimientos no son siempre cuantitativos ya que la señal de hibridación refleja el número de copias de la zona específica del genoma que corresponde a la sonda. Otros enfoques basados en la RCP cuantitativa requieren la optimización para cada locus evaluado.

El documento DE102004036285 da a conocer un procedimiento para determinar el número de copias de un cromosoma proporcionando una muestra que corresponde a una célula, es decir una copia del genoma. Varios segmentos del genoma se amplían utilizando una serie de cebadores, y se amplían en una segunda reacción de amplificación que amplía distintos fragmentos (véase los párrafos 35 y 40-41) cuya presencia se determina (en el ejemplo de DE102004036285 los fragmentos se originan a partir del cromosoma 2). El número de fragmentos amplificados se compara con el número de fragmentos amplificados en una muestra de referencia.

La presente invención se refiere a las mejoras en la detección de un cambio en el número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico.

Sumario de la invención

El procedimiento descrito en la presente memoria (al que se hace referencia como Recuento molecular del número de copias o MCC) mide la frecuencia de número de copias analizando la frecuencia con que se produce la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos (tal como un marcador genómico) al limitar la dilución de ADN.

Los procedimientos han sido validados explorando el número de copias que acortan la rama del cromosoma 3 humano en el adenocarcinoma renal para situar el punto de inflexión de una transposición no recíproca en 300 pb, permitiendo que se clone. Esta es la primera vez que se ha clonado el punto de inflexión de una transposición no recíproca de novo en el adenocarcinoma renal.

Aspectos del sumario de la presente invención

En un primer aspecto se proporciona un procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar una diversidad de alícuota(s) de la muestra, en el que cada alícuota comprende ácido nucleico en una cantidad que es inferior a un genoma por alícuota; (b) ampliar una o más secuencias de ácido nucleico en cada alícuota(s) en una primera reacción de amplificación; (c) subdividir uno o más de los productos utilizados en las alícuotas de la réplica y llevar a cabo una segunda reacción de amplificación para una o más secuencias de ácido nucleico en cada alícuota(s), en la que cada una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de prueba y por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de referencia; (d) calcular el número de copias por comparación en cada una de las alícuotas de la réplica del número de productos amplificados obtenido en el marcador de prueba con el número de productos amplificados obtenidos para el marcador de referencia.

En un segundo aspecto se proporciona un procedimiento de identificación de una o más alteraciones en una muestra de ácido nucleico, que comprende las etapas siguientes: (a) medir la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en una primera muestra y una segunda muestra según el procedimiento del primer aspecto de la presente invención; (b) opcionalmente repetir iterativamente el procedimiento a resoluciones progresivamente mayores para cada una de las muestras; y (c) identificar una o más diferencias en la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en la primera y segunda muestras.

En un tercer aspecto se proporciona un procedimiento para diagnosticar una enfermedad en un paciente, que comprende las etapas siguientes: (a) medir la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra según el procedimiento del primer aspecto de la presente invención; y (b) comparar el número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico con el número de copias normales de una o más secuencias de ácido nucleico; en la que una diferencia entre los números de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en la muestra y el número normal de copias de una o más secuencias de ácido nucleico es indicativo de que el paciente está padeciendo la enfermedad.

En un cuarto aspecto se proporciona un procedimiento para clonar una o más alteraciones en una muestra de ácido nucleico que comprende las etapas siguientes: (a) identificar una o más alteraciones en una muestra de ácido nucleico según el segundo aspecto de la presente invención; y (b) clonar...

1. Procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que comprende las etapas siguientes:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que cada alícuota en la primera reacción de amplificación comprende aproximadamente 0,1 a 0,9 genomas de ADN por reacción de amplificación.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el número de copias del marcador de prueba se calcula contando manualmente el número de productos de amplificación para el marcador de prueba y el marcador de referencia.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el número de copias del marcador de prueba se calcula utilizando la ecuación:

Np=N(1-e^-z)

en la que N es el número de alícuotas; Z es el número promedio de productos amplificados por alícuota; y Np es el número de alícuotas que cabe esperar que contenga por lo menos una molécula del ácido nucleico según la distribución de Poisson.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el número de copias del marcador de prueba se calcula utilizando la ecuación:

Z=-ln(1-Np/N)

en la que N es el número de alícuotas del ácido nucleico sometido a prueba para una secuencia dada; Np es el número de alícuotas que puntúan positivo para el ácido nucleico (es decir, por lo menos una copia de la secuencia del ácido nucleico está amplificada).

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las reacciones de amplificación se realizan utilizando PCR.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera reacción de amplificación se lleva a cabo utilizando pares cebadores directos e inversos.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la segunda reacción de amplificación se lleva a cabo utilizando pares cebadores directos-internos e inversos.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de ácido nucleico en la muestra antes de la división en alícuotas se determina por amplificación de uno o más ácidos nucleicos que se cree que están presentes en sólo una copia por genoma haploide en dos o más divisiones diferentes, en la que la proporción de muestras en cada dilución hallada positiva para uno o más ácidos nucleicos se utiliza para refinar la estimación de la concentración de ADN y determinar así la dilución requerida para el análisis posterior.

10. Procedimiento de identificación de una o más alteraciones en una muestra de ácido nucleico, que comprende las etapas siguientes:

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que las muestras son o proceden de sujetos enfermos y sanos.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la enfermedad es el cáncer.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el procedimiento se realiza inicialmente a una resolución de 2 Mb disminuyendo progresivamente hasta 100 pares de bases o menos.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la alteración es una transposición, una amplificación, una duplicación o una deleción.

15. Procedimiento para diagnosticar una enfermedad en un paciente, que comprende las etapas siguientes:

en el que una diferencia entre los números de copias de dichas una o más secuencias de ácido nucleico en la muestra y el número de copias normales de dichas una o más secuencias de ácido nucleico es indicativo de que el paciente está padeciendo la enfermedad.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que si el número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico del paciente es superior al número de copias normales es indicativo de una transposición, una amplificación o una duplicación.

17. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que si el número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico del paciente es inferior al número de copias normales es indicativo de una deleción.

18. Procedimiento para clonar una o más alteraciones en una muestra de ácido nucleico que comprende las etapas siguientes:

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la alteración se clona utilizando clonación por RCP inversa.