Composición para amplificar y detectar un ácido nucleico diana,

que consta de

- una ADN polimerasa termoestable

- una mezcla de desoxinucleósido-trifosfatos

- un tampón

- múltiples pares de cebadores de amplificación

- múltiples sondas de hibridación, cada una marcada con un distinto colorante fluorescente detectable, que solo emite fluorescencia cuando la sonda se une a su ácido nucleico diana, y dicha composición comprende adicionalmente una pirofosfatasa

PCR en tiempo real con adición de pirofosfatasa.

Ámbito de la presente invención

La presente invención se refiere al campo de la amplificación de ácidos nucleicos y al control de dicha amplificación en tiempo real. De modo más exacto la presente invención aporta una solución para realizar ensayos PCR en tiempo real, caracterizados porque los compuestos fluorescentes presentes en dichos ensayos están estabilizados apropiadamente.

Antecedentes

La amplificación de ADN mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica fundamental de la biología molecular. El análisis de ácidos nucleicos por PCR requiere la preparación de la muestra, su amplificación y el análisis del producto. Aunque estas etapas suelen efectuarse sucesivamente, la amplificación y el análisis pueden tener lugar de forma simultánea. Se pueden añadir colorantes de ADN o sondas fluorescentes a la mezcla de PCR antes de la amplificación y usarlos para analizar productos de PCR durante la amplificación. El análisis de la muestra tiene lugar al mismo tiempo que la amplificación, en el mismo tubo dentro del mismo aparato. Este método combinado disminuye la manipulación de la muestra, ahorra tiempo y reduce en gran medida el peligro de contaminación del producto para las siguientes reacciones, ya que no es necesario extraer las muestras de sus recipientes cerrados para análisis posteriores. El concepto de la amplificación combinada con el análisis del producto ha llegado a conocerse como PCR "en tiempo real". Véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 6,174,670.

Formatos de detección para la PCR en tiempo real

En la PCR en tiempo real, la formación de los productos de PCR se controla cinéticamente en cada ciclo de la misma. La amplificación suele medirse en termocicladores dotados de dispositivos adicionales para medir señales de fluorescencia durante la reacción de amplificación.

a) Formato de colorante unido a ADN

Como la cantidad de producto amplificado de cadena doble suele exceder la cantidad de ácido nucleico presente inicialmente en la muestra objeto de análisis, se pueden usar colorantes específicos para ADN de cadena doble que al excitarse con una longitud de onda apropiada emiten una fluorescencia elevada solo si están unidos a un ADN de cadena doble. Preferiblemente solo deben utilizarse aquellos colorantes que no menoscaben la eficiencia de la reacción PCR, como por ejemplo SybrGreen I.

Todos los demás formatos conocidos del estado técnico requieren el diseño de una sonda de hibridación con marcador fluorescente que solo emita fluorescencia después de unirse a su ácido nucleico diana.

b) Sonda TaqMan

Se marca una sonda de hibridación de cadena doble con dos componentes. Cuando el primer componente se excita con luz de una longitud de onda apropiada la energía absorbida se transfiere al segundo componente, el llamado extintor, según el principio de transferencia de energía resonante fluorescente. Durante la etapa de apareamiento de la reacción de PCR la sonda de hibridación se une al ADN diana y es degradada por la actividad exonucleasa 5'-3' de la Taq polimerasa en la etapa siguiente de extensión. Como resultado, el componente fluorescente excitado y el extintor se distancian entre sí, con lo cual se puede medir la emisión de fluorescencia del primer componente. Los ensayos con sonda TaqMan se describen detalladamente en las patentes US 5,210,015, US 5,538,848, y US 5,487,972. Las sondas de hibridación TaqMan y las mezclas de reactivos se revelan en la patente US 5,804,375.

c) Balizas moleculares

Estas sondas de hibridación también van marcadas con un primer componente y un extintor, con los marcadores situados preferentemente a ambos extremos de la sonda. Como resultado de la estructura secundaria de la sonda, ambos componentes están espacialmente próximos en solución. Tras la hibridación a los ácidos nucleicos diana ambos componentes quedan separados entre sí, de modo que tras la excitación con luz de una longitud de onda adecuada se puede medir la fluorescencia del primer componente (patente US 5,118,801).

d) Formato de sonda simple (SLP)

Este formato de detección consiste en un oligonucleótido simple marcado con un solo colorante fluorescente en el extremo 5' o 3' (patente WO 02/14555) . Para marcar los oligos se pueden usar dos modelos diferentes: sondas de inhibición por G y sondas de desinhibición por nitroindol. En la forma de inhibición por G el colorante fluorescente está unido a una C en el extremo 5' o 3' del oligo. La fluorescencia disminuye notablemente cuando la sonda se hibrida a la diana, en el caso de que haya dos G situadas en la cadena diana opuesta a C y en posición 1 aparte de la sonda oligonucleótida complementaria. En la forma de desinhibición por nitroindol el colorante fluorescente va unido a un nitroindol en el extremo 5' o 3' del oligonucleótido. El nitroindol reduce de algún modo la señal fluorescente de la sonda libre. La fluorescencia aumenta cuando la sonda se hibrida al ADN diana, debido a un efecto desinhibidor.

e) Sondas de hibridación FRET

El formato de ensayo con sondas de hibridación FRET es especialmente útil para todo tipo de ensayos de hibridación homogénea (Matthews, J.A., y Kricka, L.J., Anal. Biochem. 169 (1988) 1-25). Está caracterizado por dos sondas de hibridación monocatenarias que se emplean simultáneamente y que son complementarias de sitios adyacentes de la misma cadena del ácido nucleico diana amplificado. Ambas sondas están marcadas con componentes fluorescentes distintos. Al excitarse con luz de una longitud de onda adecuada, un primer componente transfiere la energía absorbida al segundo componente conforme al principio de transferencia de energía resonante fluorescente, lo que permite medir una emisión de fluorescencia del segundo componente cuando ambas sondas de hibridación se unen a posiciones adyacentes de la molécula diana objeto de detección. Como alternativa al control del aumento de fluorescencia del componente aceptor de FRET también se puede controlar el descenso de fluorescencia del componente donante de FRET como medición cuantitativa de un proceso de hibridación.

El formato de sondas de hibridación FRET puede usarse concretamente en PCR a tiempo real para detectar el ADN diana amplificado. Entre todos los formatos de detección conocidos en el estado técnico de la PCR a tiempo real se ha demostrado que el formato de sondas de hibridación FRET es muy sensible, exacto y fidedigno (véanse patentes WO 97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714). Como alternativa al uso de dos sondas de hibridación FRET también puede usarse un cebador marcado con fluorescente y solo una sonda oligonucleótida marcada (Bernard, P.S., y otros, Anal. Biochem. 255 (1998) 101-107). A este respecto puede escogerse libremente entre marcar el cebador con el compuesto donante de FRET o con el compuesto aceptor de FRET.

Aparte de la PCR y de la PCR en tiempo real, las sondas de hibridación FRET se utilizan para el análisis de curvas de fusión. En este ensayo el ácido nucleico diana se amplifica primero en una reacción de PCR típica con cebadores de amplificación adecuados. Las sondas de hibridación pueden estar presentes durante la reacción de amplificación o pueden agregarse a continuación. Una vez completada la reacción de PCR, la temperatura de la muestra aumenta constitutivamente y se detecta fluorescencia mientras la sonda de hibridación está unida al ADN diana. A la temperatura de fusión las sondas de hibridación se desprenden de su diana y la señal fluorescente decrece inmediatamente hasta su nivel de fondo. Este descenso se controla mediante un gráfico apropiado de fluorescencia frente a temperatura, de modo que pueda determinarse un valor de la primera derivada al cual se observa el máximo descenso de fluorescencia.

Todos los formatos de detección a base de sondas se pueden "multiplexar". De manera más precisa, en un recipiente de reacción se pueden amplificar múltiples dianas con múltiples pares de cebadores de amplificación y se pueden detectar con múltiples sondas de hibridación. En este caso dichas sondas múltiples van marcadas con distintos colorantes fluorescentes detectables para descubrir y discriminar las múltiples dianas que supuestamente deben encontrarse en la muestra.

Para la detección multiplex con el formato de sondas de hibridación FRET se puede emplear fluoresceína o derivados de la misma como fragmento donante de FRET en combinación con diversos fragmentos aceptores de FRET, como Cy-5, LCRed-640 o LC-red 705.

Un...

1. Composición para amplificar y detectar un ácido nucleico diana, que consta de

2. Composición según la reivindicación 1, en la cual dicha pirofosfatasa es termoestable.

3. Composición constituida por una composición según las reivindicaciones 1-2 y un ácido nucleico molde.

4. Un kit que consta de

5. Un kit formado por un kit según la reivindicación 4 y un medio de almacenamiento legible por ordenador que comprende un archivo de compensación de color.

6. Método para amplificar y detectar, al menos, un primer ácido nucleico diana, que consiste en

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque dichas múltiples sondas de hibridación son capaces de hibridarse con al menos dos, preferiblemente 3-6 y sobre todo 3-4 productos de amplificación diferentes.