PROCEDIMIENTO DE DETECCION PARA LA IDENTIFICACION DE PUFA-PKS EN MUESTRAS.

Procedimiento para identificar secuencias de ácido nucleico, específicas del gen PUFA-PKS,

en muestras, en donde (a) se lleva a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando oligonucleótidos específicos y una parte de la muestra como plantilla y (b) los productos PCR obtenidos se secuencian y la información obtenida de la secuencia se compara con bancos de datos, para identificar la nueva información de secuencia de PUFA-PKS a través de la coincidencia parcial con secuencias ya conocidas, caracterizado porque los oligonucleótidos utilizados se derivan de la secuencia de aminoácidos LGIDSIKRVEIL

5 La invención describe un procedimiento para la identificación rápida y sencilla de genes PUFA-PKS (PUFA = ácidos grasos poliinsaturados; PKS = policétido sintasa) en muestras, por ejemplo, biomasa, especialmente, en microorganismos. Se caracteriza por una reproducción in vitro de segmentos de DNA producidos específicamente para PKS que producen PUFA. Además de la

10 identificación de la secuencia de ADN correspondiente, la invención también se basa en el establecimiento de las condiciones experimentales para su reproducción. Se entiende por PUFA (ácidos grasos poliinsaturados) los ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados con una longitud de cadena > C12 y, al menos, dos dobles enlaces. Existen dos familias principales de PUFA que, según la posición del primer doble enlace en relación al extremo alquilo, se diferencian entre ácidos grasos omega-3 y omega-6. Sobre todo los fosfolípidos son importantes componentes de las membranas celulares, en donde se hallan en forma de lípidos. Los PUFA también se utilizan como precursores de moléculas importantes en humanos y en animales, por ejemplo, prostaglandinas leucotrienas y prostaciclinas (Simopoulos, A.P. Essential fatty acids in health and chronic disease (ácidos grasos esenciales en la salud y enfermedades crónicas). Am. J Clin. Nutr. 1999 (70) pág. 560-569). Importantes representares del grupo de los ácidos grasos omega-3 son el ácido docosahexaenoico (ADH) y el ácido eicosapentanoico (AEP), presentes principalmente en aceites de pescado pero también en microorganismos marinos. Un importante representante de

25 los ácidos grasos omega-6 es AAR (ácido araquidónico), que se encuentra, por ejemplo, en hongos filamentosos, pero también se puede aislar de tejidos animales como hígado y riñones. En la leche materna humana se encuentra tanto el ADH como así también el AAR. Los PUFA son esenciales para el ser humano y para su desarrollo adecuado, sobre todo, para el desarrollo del cerebro, la formación de tejidos y su reparación. El ADH es un componente importante de las membranas celulares humanas, especialmente, de los nervios. Además, el ADH juega un papel importante en la

maduración de la función cerebral y es esencial para el desarrollo de la capacidad visual. Los PUFA omega-3, como el ADH y el AEP, se utilizan como complementos nutritivos, dado que una alimentación equilibrada con suficiente suministro de ADH es ventajosa para la profilaxis de determinadas afecciones (Simopoulos, A.P. 5 Essential fatty acids in health and chronic disease (Ácidos grasos esenciales en la salud y enfermedades crónicas), American Journal of Clinical Nutrition (Revista estadounidense de nutrición clínica), 1999;70: pág. 560-569). Por ejemplo, los adultos con diabetes no insulinodependiente presentan una carencia o, al menos, alteraciones en el equilibrio de ADH, vinculadas con la posterior aparición de 10 problemas cardíacos. Del mismo modo, las enfermedades neurológicas, por ejemplo, el Alzheimer o la esquizofrenia, se vinculan con un nivel bajo de ADH. Existe una gran cantidad de fuentes para la obtención comercial de ADH, por ejemplo, aceites de peces marinos de agua fría, fracciones de yema de huevo o microorganismos marinos. Los microorganismos adecuados para la obtención de PUFA n-3 se 15 encuentran, por ejemplo, en bacterias, en el género Vibrio (por ejemplo, Vibrio Marinus) o entre los dinoflagelados (Dinophyta), entre ellos, sobre todo, el género Crypthecodinium, como C. Cohnii o entre los estramenopilos (o labyrinthulomycota), como los Pinguiophyceae, por ejemplo, Glossomastix, Phaeomonas, Pinguiochrysis, Pinguiococcus y Polypodochrysis. Otros microorganismos preferidos para la obtención de PUFA pertenecen, sobre todo, a la orden de los Thraustochytriales, (Thraustchytriidea) con los géneros Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Althornia, Labyrinthuloides, Aplanochytrium y Ulkenia. Para la obtención comercial de AAR se utilizan microorganismos de los géneros Mortierella, Entomophthora, Phytium y Porphyridium.

25 Las fuentes de uso comercial de PUFA, como plantas o animales, se caracterizan frecuentemente por una composición muy heterogénea de los aceites obtenidos por ellas. Los aceites obtenidos de ese modo deben ser sometidos a costosos procesos de purificación para poder enriquecer uno o múltiples PUFA. La alimentación con PUFA de dichas fuentes también está sometida a fluctuaciones incontrolables. Por ejemplo, las enfermedades y las influencias climáticas pueden reducir tanto las obtenciones de origen animal como vegetal. La obtención de PUFA de peces depende de fluctuaciones estacionarias y puede sufrir una restricción

transitoria importante por la pesca excesiva o debido a modificaciones climáticas (por ejemplo, El Niño). Los aceites animales, sobre todo, aceites de pescado, pueden acumular sustancias dañinas del medio ambiente a través de la cadena trófica. Sobre todo en granjas piscícolas con fines comerciales se han descubierto elevadas cargas 5 sobre los animales debido a organoclorados, por ejemplo, bifenilos policlorados, que reducen los aspectos saludables del consumo de pescado (Hites et al. 2004, Global assessment of organic contaminants in farmed salmon (Análisis global de contaminantes orgánicos en salmón cultivado), Science 303, pág. 226-229). La pérdida de calidad resultante de los productos piscícolas genera una reducción en la 10 aceptación de los consumidores de pescado o aceite de pescado como fuente de PUFA de omega-3. Además, también es relativamente costosa la purificación de ADH de pescado, debido a los grandes requerimientos técnicos. En algunos microorganismos marinos, por el contrario, el ADH se encuentra en cantidades de, aproximadamente, 50 % de la proporción total de grasas de la célula y pueden cultivarse en grandes fermentadores de manera relativamente económica. Otra ventaja de los microorganismos es una composición limitada a pocos componentes de los aceites obtenidos a partir de ellos.

Para la biosíntesis de PUFA de cadena larga se conocen dos procesos biocatalíticos diferentes. En el caso del denominado proceso Sprecher, los PUFA de 20 cadena larga, como DHA y EPA, se sintetizan partiendo de ácido palmitínico, a través de una sucesión de pasos de elongación y desaturación y posteriores acortamientos (Sprecher, H. Metabolism of highly unsaturated n-3 and n-6 fatty acids (Metabolismo de ácidos grasos altamente insaturados n-3 y n-6), Biochimica et Biophysica Acta 1486 (2000) pág. 219-231). Dicho proceso de biosíntesis es 25 realizado de este modo o de manera similar en la mayoría de los organismos, también en los humanos y vegetales. Sin embargo, cierta cantidad de microorganismos marinos hace uso de otro proceso de biosíntesis para la producción de AEP y ADH. Entre estos microorganismos que producen los PUFA, se encuentran representantes marinos de las proteobacterias Gamma y hasta ahora, el protista eucariótico 30 Schizochytrium. Sintetizan PUFA de cadena larga a través de denominados policétidos sintasa (PKS). Dichos PKS representan grandes enzimas que catalizan la síntesis de metabolitos secundarios que consisten en unidades de quétidos (Wallis,

G.W., Watts, J.L. and Browse, J. Polyunsaturated fatty acid synthesis: what will they think of next? (Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados: En qué pensarán ahora?) Trends in Biochemical Sciences 27 (9) (2002) pág. 467-473). La síntesis se los poliquétidos comprenden una serie de reacciones enzimáticas análogas a aquellas de la síntesis de ácidos grasos (Hopwood & Sherman Annu. Rev. Genet. 24 (1990), pág. 37-66; Katz a & Donadio Annu. Rev. of Microbiol. 47 (1993) pág. 875-912).

Ya se conocen secuencias de genes de denominados PUFA -PKS (PKS que sintetizan PUFA). Por ejemplo, de la bacteria marina Shewanella sp. se extrajo un fragmento genómico de 38kb, que contiene la información para la producción de ácido eicosapentanoico (AEP). A través de la transmisión del nicho (cluster) de genes de AEP presente en el fragmento genómico se pudo producir AEP en E. Coli y en Synechococcus. La posterior secuenciación de dicho fragmento permitió la identificación de 8 marcos de lectura abiertos (ORF: Open reading frames) (Takeyama, H. et al. Microbiology 143 (1997) pág. 2725-2731). Cinco de estos marcos de lectura abiertos de Shewanella presentan un parentesco cercano con genes de policétidos sintasa. Otros nichos de genes similares a PKS fueron hallados en otras bacterias marinas que producen PUFA, por ejemplo, Vibrio marinus (Tanaka,

M. et al. 21 (1999) pág. 939-945). También se identificaron ORF similares a PKS análogos que producen PUFA en el protista eucarióticos...

1. Procedimiento para identificar secuencias de ácido nucleico, específicas del gen PUFA-PKS, en muestras, en donde

(a) se lleva a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando oligonucleótidos específicos y una parte de la muestra como plantilla y

(b) los productos PCR obtenidos se secuencian y la información obtenida de la secuencia se compara con bancos de datos, para identificar la nueva información de secuencia de PUFA-PKS a través de la coincidencia parcial con secuencias ya conocidas, caracterizado porque los oligonucleótidos utilizados se derivan de la secuencia de aminoácidos LGIDSIKRVEIL.

2. Procedimiento acorde a la reivindicación 1, caracterizado porque los oligonucleótidos están degenerados.

3. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la longitud de los oligonucleótidos es de 10-36 bp, preferentemente, 15-25 bp y, de modo especialmente preferido, 18 bp.

4. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones anteriores,

caracterizado porque la cantidad de oligonucleótidos utilizados es, 20 preferentemente, de 20 pMol.

5. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la temperatura de alineamiento es de 45-65 °C, preferentemente, de 50-60 °C, de modo especialmente preferido, 53-57 °C.

6. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cantidad de ciclos es de, aproximadamente, 20-40, preferentemente, aproximadamente, 25-35 y, de modo especialmente preferido, aproximadamente 30.

7. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones anteriores,

caracterizado porque como plantilla para los PCR se utilizan ácido nucleicos 30 aislados de la biomasa o la biomasa misma.

8. Oligonucleótido que presenta una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ySEQ ID NO: 8.

9. Utilización del oligonucleótido de la reivindicación 8 como sonda de hibridación.

“Siguen 2 páginas de dibujos” Figura 1 Figura 2