Un compuesto con afinidad hacia P-selectina humana, que comprende un péptido con una secuencia de aminoácidos XAxA3A1A2A1Y,

en el que:

A1 es D- o L-cisteína (C), D- o L-metionina (M) o D- o L-valina (V);

A2 es ácido D- o L-aspártico (D);

A3 es D- o L-fenilalanina (F), D- o L-tirosina (Y) o D- o L-triptófano (W);

AX es un D- o L-aminoácido;

y en el que X marca el lado N-terminal de dicha secuencia e Y marca el lado C-terminal de dicha secuencia o en el que X e Y juntos pueden formar un sistema cíclico

Compuestos peptídicos que se unen selectivamente a P-selectina.

La presente invención se refiere a compuestos que se unen selectivamente a la molécula de adhesión P-selectina humana, a métodos para preparar tales compuestos, al uso de tales compuestos en métodos terapéuticos o diagnósticos y en composiciones farmacéuticas, a ácidos nucleicos que codifican para materiales proteínicos que comprenden las secuencias de aminoácidos de dichos compuestos, a vehículos de aporte de genes que comprenden tales ácidos nucleicos, a moléculas de unión que se unen a dichos compuestos y a un método para determinar si un compuesto es capaz de unirse a P-selectina.

Antecedentes de la invención

En los últimos años, las moléculas de adhesión a la superficie celular se han reconocido como mediadores clave en numerosos procesos celulares incluyendo el crecimiento y la diferenciación celulares, la transmigración y la respuesta de células inmunitarias y la metástasis del cáncer. Se han identificado cuatro categorías principales de moléculas de adhesión: La superfamilia de inmunoglobulinas moléculas de adhesión celular (CAMs), cadherinas, integrinas y selectinas. Las selectinas representan una familia de actualmente tres glicoproteínas transmembranosas que se unen a carbohidratos: E-selectina "endotelial", L-selectina "leucocitaria" y P-selectina "plaquetaria". Las tres selectinas dependen de cationes divalentes (p. ej. calcio) y poseen un dominio extracelular con un motivo de reconocimiento de carbohidrato, un motivo similar al factor de crecimiento epidérmico y algunos dominios menores relacionados con proteínas reguladoras del complemento.

La P-selectina humana (también denominada GMP-140, LECAM-3, PAD-GEM, CD62, CD62P) es expresada por plaquetas y células endoteliales. Cuando se expresa sobre las superficies de estas células, su efecto más notable es la pérdida de velocidad de leucocitos a medida que estos abandonan los capilares y entran en las vénulas poscapilares, representando las últimas la zona principal de adhesión leucocito-endotelio. El proceso de pérdida de velocidad se observa como rodamiento de leucocitos, que significa una adhesión inicial con una afinidad relativamente baja. La adhesión firme de leucocitos rodantes está mediada principalmente por integrinas.

En las células endoteliales, la P-selectina se almacena en los cuerpos de Weibel-Palade; en las plaquetas, se encuentra en los gránulos a. Después de la activación, la P-selectina se moviliza hasta las superficies celulares en unos pocos minutos en respuesta a una variedad de agentes inflamatorios o trombogénicos. La función primaria de la P-selectina endotelial es reclutar leucocitos hacia las vénulas poscapilares, mientras que la P-selectina plaquetaria también da como resultado la formación de trombos. Uno de los ligandos de P-selectina actualmente conocidos es el PSGL-1 (ligando 1 de glicoproteína de P-selectina), una sialoproteína de 160 kDa expresada sobre la superficie de leucocitos donde se concentra en el urópodo. Descripciones más detalladas de la estructura y las funciones de la P-selectina se encuentran en numerosas publicaciones, tales como J. Panes, Pathophysiology 5, 271 (1999); F. Chamoun et al., Frontiers in Bioscience 5, e103 (1 de nov. de 2000); S.-I. Hayachi, Circulation 102, 1710 (2000).

La P-selectina también parece estar implicada más directamente en la agregación de plaquetas, como se mostraba recientemente mediante estudios de las interacciones independientes del Ca de P-selectina con galactosilceramida sulfatada en 3 (también denominada sulfátidos). Esta interacción probablemente tiene lugar en un sitio de unión diferente de P-selectina, ya que la unión puede ser inhibida por el anticuerpo WASP12.2, pero no por AK4, mientras que la unión del ligando de P-selectina natural PSGL-1, que está implicado en la adhesión de leucocitos, es bloqueada tanto por WASP12.2 como por AK4. Sin embargo, parece que los sitios de unión están solapados. Se supone que las interacciones con sulfátidos estabilizan los agregados de plaquetas.

La inflamación y los procesos inflamatorios representan un papel fundamental en la patofisiología de numerosas enfermedades y afecciones. Afecciones del cerebro en la que se encontraban niveles incrementados de selectina, y que por lo tanto pueden implicar episodios patofisiológicos mediados por selectina, incluyen lesión cerebral traumática grave, esclerosis múltiple recurrente-remitente, oclusión de las arterias cerebrales, isquemia y apoplejía. Afecciones del corazón en las que se sugiere que las selectinas representan un papel incluyen infarto de miocardio agudo, lesión arterial, tal como la producida por angioplastia, e isquemia. De forma similar, las selectinas están implicadas en afecciones de los riñones, tales como lesión renal por isquemia y reperfusión, y fallo renal. Por otra parte, las selectinas parecen representar un papel en el rechazo del trasplante de órganos, la isquemia fría, el choque hemorrágico, el choque séptico, la metástasis tumoral, la inflamación crónica, la artritis reumatoide, la enfermedad inflamatoria del intestino, la aterosclerosis, la reestenosis, la angiogénesis, la coagulación intravascular diseminada, el síndrome de fatiga respiratoria del adulto y el choque circulatorio.

Así, parecería factible mejorar estas y otras afecciones que implican la activación de células endoteliales y leucocitos y específicamente la movilización y la expresión de P-selectina interrumpiendo específicamente las cascadas de P-selectina. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante la administración de ligandos que se unen selectivamente a P-selectina humana, pero que no poseen su bioactividad. Mediante este método, la P-selectina movilizada podría inactivarse y el daño tisular inducido por leucocitos podría prevenirse. Potencialmente, el mismo efecto podría conseguirse mediante terapia génica, con tal de que el ligando o el antagonista de P-selectina sea un péptido o un péptido modificado. De acuerdo con este método, las células somáticas de una persona que necesite la terapia se transfectarían con un vector de expresión que tiene una secuencia de DNA que codifica un antagonista de P-selectina.

Los ligandos o antagonistas de P-selectina también pueden usarse para la prevención de enfermedades y afecciones descritas anteriormente. Por otra parte, tales ligandos también pueden ser útiles en la diagnosis de estas enfermedades in vivo o in vitro.

En los últimos años, se han realizado diversos intentos de identificar o crear tales ligandos selectivos para P-selectina. Hasta ahora, se ha probado un número de sustancias, pero los estudios clínicos no han proporcionado todavía una evidencia concluyente de que alguno de estos compuestos produzca los efectos clínicos deseados siendo a la vez tolerable en términos de efectos secundarios.

Por ejemplo, se encontró que los anticuerpos para P-selectina que se producían y se probaban en modelos animales protegían los riñones de la lesión isquémica por reperfusión (H. C. Rabb et al., JASN 5, 907, 1997; US-A-6.033.667). En otro estudio, se usó una forma soluble recombinante de ligando-1 de glicoproteína de P-selectina (rPSGL-Ig) para inhibir la trombosis en gatos (M. J. Eppihimer et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 20, 2483, 2000). WO-A-96/09309 divulga estructuras de oligosacárido que son ligandos para E- y P-selectina. WO-A-99/41363 divulga proteínas similares a podocalixina que se unen a selectinas. WO-A-00/41711 describe diversos péptidos o secuencias peptídicas menores que se unen a miembros de la familia de selectinas humanas; la mayoría de las secuencias comprende una o más unidades de leucina o isoleucina.

Como otro sistema para inhibir la cascada de P-selectina, se encontró que diversos péptidos derivados del dominio de lectina de la familia de selectinas inhiben la adhesión de neutrófilos a P-selectina (p. ej. US-A-6.111.065 y US-A-5.916.876); estos péptidos probablemente se unen a receptores de P-selectina sobre leucocitos.

En WO-A-94/05269, se describen péptidos que inhiben la unión de selectinas tales como P-selectina, E-selectina y L-selectina. Estos péptidos tienen como su región central porciones de la secuencia de 11-18 aminoácidos de P-selectina, E-selectina o L-selectina. Por otra parte, WO-A-95/31210 se refiere a péptidos y compuestos que se unen a selectinas, incluyendo molécula 1 de adhesión a leucocitos endoteliales (ELAM-1). Estos péptidos se usan para bloquear la adhesión de leucocitos a las selectinas, es decir, especialmente E-selectina,...

1. Un compuesto con afinidad hacia P-selectina humana, que comprende un péptido con una secuencia de aminoácidos XA_xA₃A₁A₂A₁Y, en el que:

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia comprende además un aminoácido A₄ en el extremo N-terminal o C-terminal, en el que

A₄ es un D- o L-aminoácido que comprende una cadena lateral hidrófila.

3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1o la reivindicación 2, en el que A_X representa ácido D- o L-glutámico (E) o comprende A₂.

4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que A₁ es valina (V).

5. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que A₃ es triptófano (W).

6. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que X comprende al menos dos aminoácidos, siendo uno de ellos ácido aspártico (D).

7. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una estructura de cadena principal cíclica o restringida.

8. Una composición multímera que comprende al menos dos péptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo dicha composición una constante de afinidad para la unión a P-selectina que es menor de 1/20, y preferiblemente menor de 1/100, de la afinidad de uno de dichos péptidos.

9. Un método para la preparación de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que monómeros de aminoácido u oligómeros de aminoácido se ensamblan mediante ligación química o enzimática, que se realiza en una fase líquida y/o en la interfase con una fase sólida funcionalizada.

10. Un método para la preparación de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende las etapas de:

11. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composición multímera de acuerdo con la reivindicación 8, para el uso como un medicamento o un agente diagnóstico.

12. Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composición multímera de acuerdo con la reivindicación 8, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento, la prevención o la diagnosis de trastornos inflamatorios crónicos, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, aterosclerosis, reestenosis, isquemia, lesión por reperfusión incluyendo fallo renal, metástasis tumoral, sepsis bacteriana, coagulación intravascular diseminada, síndrome de fatiga respiratoria del adulto, apoplejía, angiogénesis, rechazo de trasplantes, trombosis o choque circulatorio.

13. Composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composición multímera de acuerdo con la reivindicación 8 y uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

14. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, que se formula y se procesa para administración parenteral, preferiblemente para inyección intravascular, intramuscular, subcutánea o intralesional.

15. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, que se formula y se procesa para administración oral, preferiblemente en forma de un comprimido, una cápsula, gránulos, una forma de dosificación sólida entérica, una forma de dosificación sólida que proporciona liberación sostenida o controlada o una forma de dosificación que se desintegra oralmente.

16. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, que se formula y se procesa para administración transmucosal, tal como administración nasal, bucal, sublingual o vaginal.

17. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, que se formula y se procesa para administración pulmonar a través de un inhalador de dosis medidas, un nebulizador, un dispensador de pulverización de aerosol o un inhalador de polvo seco.

18. Composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, que comprende además un agente de orientación de fármacos y/o un agente que potencia la biodisponibilidad.

19. Un método para determinar si una molécula comprende una afinidad de unión hacia P-selectina, que comprende poner en contacto P-selectina con dicha molécula y con un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y determinar si se reduce la unión de dicho compuesto a dicha P-selectina.

20. Un ácido nucleico que codifica una molécula proteínica que comprende una secuencia de aminoácidos XA_xA₃A₁A₂A₁Y, en el que:

21. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicha secuencia de aminoácidos comprende además un aminoácido A₄ en el extremo N-terminal o C-terminal, en el que A₄ es un D- o L-aminoácido que comprende una cadena lateral hidrófila.

22. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 20 o la reivindicación 21, para la preparación de un medicamento.

23. Un vehículo de aporte de genes que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 20 o la reivindicación 21.

24. Una molécula de unión capaz de unirse específicamente a un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la molécula de unión es un anticuerpo monoclonal específico para dicho compuesto.

25. Un método para determinar si un compuesto es capaz de unirse a P-selectina humana, que comprende sustituir, en un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, un aminoácido por un aminoácido conservativo y determinar si el compuesto resultante es capaz de unirse a dicha P-selectina.