Aparato para la detección de ADN diana en una muestra biológica que usa hibridación eléctrica,

que comprende un substrato formado con al menos una célula de reacción que tiene una capa de óxido de aluminio que proporciona una superficie sobre la cual las sondas de captura de ADN están unidas; y medios para uso de hibridación eléctricamente asistida entre dicho ADN diana y dichas sondas de captura

Aparato y procedimientos de detección de ADN en muestras biológicas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a aparatos y procedimientos para la detección de ADN en muestras biológicas. En particular, la presente invención se refiere a nuevos aparatos para la detección de secuencias de ADN que usan hibridación de ácido nucleico eléctricamente asistida y a procedimientos para la optimización del comportamiento de dichos aparatos.

Antecedentes de la invención

El uso de hibridación de ácido nucleico eléctricamente asistida es una técnica conocida en el análisis de muestras biológicas que contienen ADN, por ejemplo, sangre, plasma, orina, etc. Convencionalmente, se forma un chip para la detección de ADN a partir de un material de entre una diversidad de materiales que incluyen vidrio, sílice y metal. Sobre la superficie del chip se forman un cierto número de contactos eléctricos usando técnicas conocidas. Para detectar una secuencia de ADN particular en una muestra biológica, a la superficie del chip se unen sondas de captura constituidas por fragmentos de ADN complementarios. Si una muestra biológica contiene el ADN diana, el ADN diana se unirá a los fragmentos de ADN complementarios mediante hibridación, y pueden usarse diversas técnicas de obtención de imágenes para detectar dicha hibridación y, por tanto, la presencia en la muestra del ADN diana. Mediante la aplicación de una corriente eléctrica a las sondas de captura, puede acelerarse el procedimiento de hibridación y, en consecuencia, se acelera igualmente el procedimiento de detección. Esta técnica de hibridación básica se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. 5.849.486.

Técnica anterior

En dichos dispositivos y técnicas, las aplicaciones principales implicadas son la unión de las sondas de captura a la superficie del chip, y la obtención de imágenes y visualización de la hibridación cuando esta se produce. Con referencia a esto último, un procedimiento tradicional de detección es la fluorescencia, pero más recientemente Taton y otros (Science, vol. 289, págs. 1757-1760, (8 Septiembre 2000)) describe el uso nanopartículas de oro recubiertas con estreptavidina para la detección. En dicha técnica, las nanopartículas de oro están recubiertas con una secuencia de oligonucleótido complementaria de la secuencia de ADN diana. Una solución que contiene dichas nanopartículas de oro recubiertas se pasa sobre la superficie del chip y, a continuación, las partículas de oro se unirán a cualquier sonda a la cual esté unido el ADN diana. Las partículas de oro por sí mismas son demasiado pequeñas para ser detectadas, pero la superficie del chip puede, a continuación, incubarse con una solución que contiene iones de plata. Los iones de plata se depositan sobre la superficie de las nanopartículas de oro para formar una capa de plata visible, la cual puede detectarse mediante aparatos de obtención de imágenes convencionales.

Con referencia a la unión de las sondas de captura a la superficie del chip, una dificultad es que la unión de los oligonucleótidos de ADN sobre la superficie del chip (por ejemplo, una oblea de sílice) es una etapa crítica que es altamente sensible a las alteraciones en las condiciones experimentales. En particular, cuando se aplica una corriente eléctrica durante el procedimiento de hibridación eléctricamente asistida, puede producirse electrolisis que puede afectar negativamente las reacciones y detección posteriores. Es conocida, por ejemplo, la forma de recubrir la superficie del chip con un gel de agarosa y de marcar los el ADN de oligonucleótidos usados como sondas de captura en un extremo con biotina y de embeberlos en la capa de agarosa debido a la reacción de alta afinidad entre la biotina y la estreptavidina que está disuelta en la agarosa antes del recubrimiento de la superficie del chip.

Sin embargo, existen un cierto número de problemas cuando se usa agarosa. En primer lugar, es muy difícil manipular un gel de agarosa fundido con el fin de mantener un recubrimiento por igual sobre el chip. Además, la densidad y concentración del gel de agarosa debe controlarse de manera precisa. En consecuencia, la fabricación de un chip con una capa de agarosa adecuada es muy difícil. Además, una vez aplicado el gel debe mantenerse húmedo para prevenir el secado y fisuración, y la agarosa es muy inestable y se degrada a altas temperaturas y, por ello, el chip debe refrigerarse después de la aplicación de la capa de agarosa. Así mismo, la capa de agarosa es muy delicada y susceptible a tensiones mecánicas, y, en consecuencia, el almacenamiento y transporte del chip acabado es difícil. En cualquier caso, el uso de un gel de agarosa no evita los problemas potenciales causados por la electrolisis.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un aparato para la detección de ADN diana en una muestra biológica que usa hibridación eléctrica, que comprende un substrato formado con al menos una célula de reacción que tiene una capa de óxido de aluminio que proporciona una superficie sobre la cual las sondas de captura de ADN están unidas; y medios para uso de hibridación eléctricamente asistida entre dicho ADN diana y dichas sondas de captura.

Mediante esta disposición pueden superarse algunos de los problemas con la técnica anterior o al menos mitigarse dado que el óxido de aluminio proporciona una superficie de unión estable que es fácil de formar y de manipular, facilita la posterior manipulación y almacenamiento del aparato, y evita o al menos mitiga los problemas con la electrólisis.

La superficie de unión de óxido de aluminio puede formarse mediante la oxidación de una capa de aluminio previamente formada, o de manera correcta, por ejemplo mediante pulverización catódica.

Un procedimiento de unión de las sondas de captura a la capa de óxido de aluminio incrementaría la comodidad de fabricación. Una capa de unión absorbida sobre el óxido de aluminio llevaría a cabo esta función. Es importante igualmente ser capaz de orientar de manera correcta las sondas de captura con respecto a la capa de unión. Una proteína puede llevar a cabo ambas actividades.

Preferiblemente, esta proteína puede ser un anticuerpo contra una proteína usada para marcar las sondas de captura de ADN, de manera tal que las sondas de captura puedan estar ligadas a la superficie de unión a través de un par de ligamiento anticuerpo-proteína en una orientación definida. Sin embargo, como alternativa, la superficie podría recubrirse con cualquier proteína y las sondas de captura pueden marcarse con una proteína que tenga una alta afinidad con la primera proteína, por ejemplo, estreptavidina y/o biotina.

Para reducir la señal de fondo, la superficie de unión puede recubrirse con un reactivo tal como albúmina, ADN de esperma de salmón, Ficoll, u otra proteína. Vista desde un aspecto aún adicional, la invención se amplía a un procedimiento de detección de ADN diana en una muestra biológica, que comprende las etapas de lo siguiente:

(a) proporcionar una célula de reacción formada con una superficie de óxido de aluminio que está recubierta con un primer compuesto para asegurar la correcta orientación de la sonda de captura,

(b) agregar a dicha célula una solución que contiene sondas de captura formadas con una secuencia de ADN complementaria a dicho ADN diana y marcadas con un segundo compuesto que tiene alta afinidad con dicho primer compuesto,

(c) suministrar dicha muestra a dicha célula,

(d) agregar a dicha célula una solución que contiene sondas de detección de ADN diana formadas con una secuencia de ADN complementaria a dicho ADN diana para hibridación eléctrica con el ADN diana,

(e) proporcionar una corriente eléctrica para uso en la hibridación eléctricamente asistida entre dicho ADN diana y dichas sondas de captura,

(f) agregar a dicha célula medios para generar una señal detectable en una célula en la que ha sido capturado el ADN diana por dichas sondas de captura y detectado por dichas sondas de detección, y

(g) detectar dicha señal.

Visto desde un aspecto adicional aún, la presente invención proporciona un chip de ADN para la detección de ADN diana en una muestra que usa hibridación eléctrica, que comprende un substrato que incluye al menos una célula de reacción, teniendo dicha al menos una célula de reacción una capa de óxido de aluminio con una superficie sobre la cual son unibles las...

1. Aparato para la detección de ADN diana en una muestra biológica que usa hibridación eléctrica, que comprende un substrato formado con al menos una célula de reacción que tiene una capa de óxido de aluminio que proporciona una superficie sobre la cual las sondas de captura de ADN están unidas; y medios para uso de hibridación eléctricamente asistida entre dicho ADN diana y dichas sondas de captura.

2. Aparato tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicha superficie de óxido de aluminio está formada mediante la oxidación de una capa de aluminio.

3. Aparato tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicha superficie de óxido de aluminio está formada mediante una técnica de pulverización catódica.

4. Aparato tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha superficie de óxido de aluminio está recubierta con un primer compuesto para actuar como capa de unión para la sonda de captura.

5. Aparato tal como se reivindica en la reivindicación 4, en el que dicho aparato comprende además sondas de captura unidas a dicha superficie de óxido de aluminio, y en el que dichas sondas de captura están marcadas con un segundo compuesto el cual puede unirse a dicho primer compuesto.

6. Aparato tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dicho primer y segundo compuestos comprenden un par anticuerpo-proteína.

7. Aparato tal como se reivindica en la reivindicación 6, en el que dicho primer compuesto comprende anticuerpos anti-digoxigenina, y en el que dicho segundo compuesto comprende digoxigenina.

8. Aparato tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dicho primer y segundo compuestos comprenden estreptavidina o biotina, o vice versa.

9. Aparato tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha superficie de óxido de aluminio está recubierta con una primera molécula para actuar como una capa de unión para la sonda de captura.

10. Aparato tal como se reivindica en la reivindicación 9, en el que dicho aparato comprende además sondas de captura unidas a dicha superficie de óxido de aluminio, y en el que dichas sondas de captura están marcadas con una segunda molécula que tiene afinidad con dicha primera molécula.

11. Aparato tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicha capa de óxido de aluminio tiene un espesor de al menos 50 Å.

12. Aparato tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que dicha superficie de óxido de aluminio está recubierta con un reactivo para reducir la señal de fondo en un procedimiento de detección.

13. Aparato tal como se reivindica en la reivindicación 12, en el que dicho reactivo comprende ADN de esperma de salmón.

14. Aparato tal como se reivindica en la reivindicación 12, en el que dicho reactivo comprende albúmina, u otra proteína, o Ficoll.

15. Un procedimiento de detección de ADN diana en una muestra biológica, que comprende las etapas de lo siguiente:

(a) proporcionar una célula de reacción que está libre de cualquier capa de agarosa o gel y formada con una superficie de óxido de aluminio que está recubierta con un primer compuesto para asegurar la correcta orientación de la sonda de captura,

(b) agregar a dicha célula una solución que contiene sondas de captura formadas con una secuencia de ADN complementaria a dicho ADN diana y marcadas con un segundo compuesto que tiene alta afinidad con dicho primer compuesto,

(c) suministrar dicha muestra a dicha célula,

(d) agregar a dicha célula una solución que contiene sondas de detección de ADN diana formadas con una secuencia de ADN complementaria a dicho ADN diana para hibridación eléctrica con el ADN diana,

(e) proporcionar una corriente eléctrica para uso en la hibridación eléctricamente asistida entre dicho ADN diana y dichas sondas de captura,

(f) agregar a dicha célula medios para generar una señal detectable en una célula en la que ha sido capturado el ADN diana por dichas sondas de captura y detectado por dichas sondas de detección, y

(g) detectar dicha señal.

16. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 15, en el que dicho primer y segundo compuesto comprenden un par anticuerpo-proteína.

17. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 16, en el que dicho primer y segundo compuesto anti-digoxigenina y digoxigenina.

18. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 16, en el que dicho primer y segundo compuesto comprenden un par de proteínas o de moléculas de no proteína que reaccionan con afinidad entre sí.

19. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 16, en el que dicho primer y segundo compuesto comprenden estreptavidina o biotina, o vice versa.

20. Un procedimiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 15-19, que comprende además la adición de un reactivo para reducir la señal de fondo.

21. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 20, en el que dicho reactivo para reducir la señal de fondo es albúmina o está obtenido de ADN de esperma de salmón.

22. Un procedimiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 15-21, en el que en la etapa (f) dichos medios para generar dicha señal incluyen una solución de nanopartículas de oro recubiertas con estreptavidina que se unen a dicha sonda de detección, y una solución de iones de plata que están reducidos sobre la superficie de dichas nanopartículas de oro, para formar depósitos de plata.

23. Un chip de ADN para la detección de ADN diana en una muestra mediante el uso de hibridación eléctrica, que comprende un substrato que incluye al menos una célula de reacción, teniendo dicha al menos una célula de reacción una capa de óxido de aluminio con una superficie sobre la cual están unidas sondas de captura de ADN, y medios para uso de hibridación eléctricamente asistida entre dicha diana y dichas sondas de captura.

24. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 23, en el que dicha corriente eléctrica es una corriente eléctrica con impulsos.