Un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO:

2, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 76 a SEQ ID NO: 11 8, inclusive, en el que dicho polipéptido es capaz de unirse a Ang-2, y sus sales fisiológicamente aceptables

Agentes de unión específica de la angiopoyetina-2.

La presente solicitud reivindica el beneficio para la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº de serie 60/328.624 presentada el 11 de octubre de 2001.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a agentes de unión específica que reconocen, y se unen a, angiopoyetinas-2 (Ang-2). Más específicamente, la invención se refiere a la producción, uso diagnóstico, y uso terapéutico de los agentes de unión específica y sus fragmentos, que específicamente se unen a Ang-2.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los existentes, es esencial para muchos procesos fisiológicos y patológicos. Normalmente, la angiogénesis está estrechamente regulada por factores pro- y anti-angiogénicos, pero en el caso de enfermedades tales como cáncer, enfermedades neovasculares oculares, artritis, y psoriasis, el proceso puede fracasar. Folkman, J. Nat. Med., 1: 27 - 31(1995).

Existen numerosas enfermedades que se sabe que están asociadas a la angiogénesis no regulada o no deseada. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, neovascularización ocular, tales como retinopatías (incluyendo retinopatía diabética), degeneración macular relacionada con la edad, psoriasis, hemangioblastoma, hemangioma, arterioesclerosis, enfermedad inflamatoria, tal como enfermedad inflamatoria reumatoide o reumática, especialmente artritis (incluyendo artritis reumatoide), u otros trastornos inflamatorios crónicos, tales como asma crónica, aterosclerosis arterial después de transplante, endometriosis y enfermedades neoplásicas, por ejemplo los llamados tumores sólidos y tumores líquidos (o hematopoyéticos) (tales como leucemias y linfomas). Otras enfermedades asociadas a la angiogénesis no deseada será evidente para los expertos en la técnica.

Aunque han estado implicados muchos sistemas de transducción de señal en la regulación de angiogénesis, uno de los sistemas mejor caracterizados y más selectivos de las células endoteliales implica el receptor Tirosina quinasa Tie -2 (denominado "Tie-2" o "Tie-2R" (también denominado "ORK"); Tie-2 murino también denominado "tek") y sus ligandos, the angiopoyetinas (Gale, N. W. y Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13: 1055 - 1066 [1999]). Existen 4 angiopoyetinas conocidas; angiopoyetina-1 ("Ang-1") a la angiopoyetina-4 ("Ang-4"). Estas angiopoyetinas también denominadas "ligandos de Tie-2". (Davis, S., et al., Cell, 87: 1161 - 1169 [1996]; Grosios, K., et al., Cytogenet Cell Genet, 84: 118 - 120 [1999]; Holash, J., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42: 1617 - 1625 [1999]; Koblizek, T. I., et al., Current Biology, 8529 - 532 [1998]; Lin, P., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 958829 - 8834 [1998]; Maisonpierre, P. C., et al., Science, 277:55-60 [1997]; Papapetropoulos, A,, et al., Lab Invest, 79: 213 - 223 [1999]; Sato, T. N,, et al., Nature, 37570 - 74 [1998]; Shyu, K. G., et al., Circulation, 98:2081-2087 [1998]; Suri, C., et al., Cell, 87:1171-1180 [1996]; Suri, C., et al., Science, 282:468-471 [1998]; Valenzuela, D. M., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96: 1904 - 1909 [1999]; Witzenbichler, B., et al., J Biol Chem, 273: 18514 - 18521 [1998]). Mientras Ang-1 que se une a Tie-2 estimula una fosforilación de receptor en células endoteliales cultivadas, Ang-2 se ha observado que tanto agoniza como antagoniza la fosfolización del receptor de Tie-2 (Davis, S., et al., [1996], supra; Maisonpierre, P.C., et al., [1997], supra; Kim, I., J.H. Kim, et al., Oncogene 19 (39): 4549-4552 (2000); Teichert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, et al., Cardiovascular Research 49(3): 659-70 (2001)).

Los fenotipos de inactivaciones de Tie-2 y Ang-1 de ratón son similares y sugieren que la fosforilación de Tie-2 estimulada por Ang-1 media la remodelación y estabilización del desarrollo de de vasos en el útero mediante el mantenimiento de la adhesión de células soporte de las células endoteliales (Dumont, D. J., et al., Genes & Development, 8: 1897 - 1909 [1994]; Sato, T. N,, et al., Nature, 376: 70 - 74 [1995]; Suri, C., et al., supra). El papel de Ang-1 en la estabilización de los vasos se cree que se conserva en el adulto, donde se expresa de manera amplia y de manera constitutiva (Hanahan, D., Science, 277: 48 - 50 [1997]; Zagzag, D., et al., Experimental Neurology, 159: 391 - 400 [1999]). Por el contrario, la expresión de Ang-2 está principalmente limitada a sitios de remodelación vascular, donde se cree que bloquean la función de Ang-1, induciendo por lo tanto un estado de plasticidad vascular que conduce a la angiogénesis (Hanahan, D., [1997], supra; Holash, J., et al., Science, 284:1994-1998 [1999]; Maisonpierre, P. C., et al., [1997], supra).

Numerosos estudios publicados han demostrado supuestamente que la expresión de Ang-2 selectiva de los vasos en estados patológicos asociados a la angiogénesis. Estas afecciones patológicas incluyen, por ejemplo, psoriasis, degeneración macular, y cáncer (Bunone, G., et al., American Journal of Pathology, 155:1967 - 1976 [1999]; Etoh, T., et al., Cancer Research, 61 : 2145 - 2153 [2001]; Hangai, M., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42: 1617 - 1625 [2001]; Holash, J., et al., [1999] supra; Kuroda, K., et al., Journal of Investigative Dermotology 11 6:713-720 [2001]; Otani, A., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40: 1912 - 1920 [1999]; Stratmann, A., et al., American Journal of Pathology, 153: 1459 - 1466 [1998]; Tanaka, S., et al., J Clin Invest, 103: 34 - 345 [1999]; Yoshida, Y., et al., International Journal of Oncology, 15: 1221 - 1225 [1999]; Yuan, K., et al., Journal of Periodontal Research, 35: 165 - 171 [2000]; Zagzag, D., et al., [1999] supra). La mayoría de estos estudios se han centrado en el cáncer, en los que muchos tipos de tumores parecen mostrar la expresión de Ang-2 vascular. Al el contrario que esta expresión en la angiogénesis patológica, la expersión de Ang-2 en tejidos normales está extremadamente limitada (Maisonpierre, P. C., et al., [1997], supra; Mezquita, J., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 260: 492-498 [1999]). En el adulto normal, los tres sitios principales de angiogénesis son el ovario, placenta, y útero; éstos son los tejidos primarios en los tejidos normales (es decir, no-cancerosos) en los que se ha detectado el ARNm de Ang-2.

Ciertos estudios funcionales sugieren que Ang-2 puede estar implicado en la angiogénesis de tumores. Ahmad et al. (Cancer Res., 61: 1255 - 1259 [2001]) describen la sobre expresión de Ang-2 y muestran que está asociado de manera supuesta a un incremento en el desarrollo del tumor en un modelo de heterotrasplante de ratón. Véase también Etoh et al., supra, y Tanaka et al., supra, en el que los datos presentan una asociación supuesta de la sobreexpresión de Ang-2 con la hipervascularidad del tumor. Sin embargo, por el contrario, Yu et al. (Am. J. Path., 158: 563 - 570 [2001]) reseñan datos que muestran que la sobreexpresión de Ang-2 en las células de carcinoma de pulmón de Lewis y carcinoma mamario TA3 supuestamente prolongan la supervivencia de los ratones inyectados con los transfectantes correspondientes.

En los últimos años, diversas publicaciones han sugerido Ang-1, Ang-2 y/o Tie-2 como posible diana para la terapia anticáncer. Por ejemplo, las Patentes de estados Unidos números 6.166.185, 5.650.490 y 5.814.464 describen el concepto de los anticuerpos de ligando anti-Tie-2 ligand y los anticuerpos del receptor. Lin et al. (Proc. Natl. Acad Sci USA, 95: 8829 - 8834 [1998]) inyectaron un adenovirus que expresa Tie-2 soluble en ratones; el Tie-2 soluble supuestamente disminuyó el número y tamaño de los tumores desarrollados por los ratones. En un estudio relacionado, Lin et al (J. Clin. Invest., 100: 2072 - 2078 [1997]) inyectaron una forma soluble de Tie-2 en ratas; este compuesto supuestamente reduce el tamaño del tumor en las ratas. Sienieister et al. (Cancer Res., 59: 31 85 - 31 89 [1999]) generaron líneas celulares de melanoma que expresan el dominio extracelular de Tie-2, inyectaron estas líneas celulares en ratones desnudos y concluyeron que Tie-2 soluble supuestamente dio como resultado una "inhibición significativa" de crecimiento de tumor y angiogénesis...

1. Un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 76 a SEQ ID NO: 11 8, inclusive, en el que dicho polipéptido es capaz de unirse a Ang-2, y sus sales fisiológicamente aceptables.

2. Un polipéptido de fusión que comprende al menos un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo, en el que dicho polipéptido de fusión es capaz de unirse a Ang-2, y sus sales fisiológicamente aceptables.

3. El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 2 en el que dicho vehículo es al menos un de un dominio de Fc, polietilenglicol, un lípido, un grupo colesterol, un carbohidrato, y un oligosacárido.

4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que es cíclico.

5. un dímero o multímero de los polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1.

6. Una composición que tiene la fórmula:

(X¹)_a-F¹-(X²)_b

y sus multímeros, en la que:

F¹ es un vehículo, en la que dicho vehículo es un dominio de Fc, polietilenglicol, un lípido, un grupo colesterol, un carbohidrato, o un oligosacárido.

X¹ y X² se seleccionan cada uno de ellos independientemente entre

en las que uno o más de P¹, P², P³, y P⁴ cada uno de ellos independientemente comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 76 a SEQ ID NO: 118, inclusive;

L¹, L², L³, y L⁴ son cada uno de ellos independientemente engarces; y

a, b, c, d, e, y f son cada uno de ellos independientemente 0 ó 1, a condición de que al menos uno de a y b sea 1;

y sus sales fisiológicamente aceptables.

7. La composición de la reivindicación 6 de las fórmulas: o

X¹-F¹

o

F¹-X²

y sus sales fisiológicamente aceptables.

8. La composición de la reivindicación 6 de la fórmula:

F¹-(L¹)_c-P¹

y sus sales fisiológicamente aceptables.

9. La composición de la reivindicación 6 de la fórmula:

F¹-(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²

y sus sales fisiológicamente aceptables.

10. La composición de la reivindicación 6 de la fórmula:

P¹-(L¹)_c-F¹-(L²)_d-P²

y sus sales fisiológicamente aceptables.

11. La composición de la reivindicación 6, en la que F¹ es un dominio de Fc o su fragmento.

12. La composición de la reivindicación 6 en la que F¹ comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60.

13. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

14. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 13.

15. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 14.

16. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 15 en la que la célula es una célula procariótica.

17. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 16 en la que la célula es una célula de E. coli.

18. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 15 en la que la célula es una célula eucariótica.

19. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.

20. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo.

21. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 6 para uso en un procedimiento de tratamiento de angiogénesis en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento la administración una cantidad eficaz del polipéptido.

22. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 21 para uso en un procedimiento de tratamiento de angiogénesis, en el que dicho procedimiento comprende la inhibición de angiogénesis no deseada en un mamífero, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido.

23. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 21 para uso en un procedimiento de tratamiento de angiogénesis, en el que dicho procedimiento comprende la modulación de angiogénesis en un mamífero, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido.

24. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 21 para uso en un procedimiento de tratamiento de angiogénesis, en el que dicho procedimiento comprende la inhibición de crecimiento de tumor caracterizado por la angiogénesis no deseada en un mamífero, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido.

25. Una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 6 y un agente quimioterapéutico para uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer en un mamífero, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido y agente quimioterapéutico.

26. El polipéptido y agente quimioterapéutico de acuerdo con la reivindicación 25 en la que el agente quimioterapéutico es al menos uno de 5-FU, CPT-11, y Taxotere.

27. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 6 para uso en un procedimiento de modulación de al menos uno de entre permeabilidad vascular o fuga de plasma en un mamífero que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido.

28. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 6 para su uso en un procedimiento de tratamiento de al menos uno de entre enfermedad neovascular ocular, obesidad, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerosis, enfermedad inflamatoria, trastornos inflamatorios, aterosclerosis, endometriosis, enfermedad neoplásica, enfermedad relacionada con los huesos, o psoriasis en un mamífero que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido.

29. Un polipéptido capaz de unirse a Ang-2, comprendiendo dicho polipéptido la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 25), y sus sales fisiológicamente aceptables.

30. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 29 en el que la secuencia de aminoácidos del Fc en la SEQ ID NO: 25 se establece en la SEQ ID NO: 60.

31. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 - 30.

32. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 31 como se establece en la SEQ ID NO: 46.

33. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de las reivindicaciones 31 ó 32.

34. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 33.

35. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 34 en la que la célula es una E. coli.

36. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 - 30 mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo.

37. Un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 29 - 30 para su uso en un procedimiento de inhibición de angiogénesis en un mamífero que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho polipéptido.

38. Un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 29 - 30 para su uso en un procedimiento de tratamiento angiogénesis en un sujeto que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho polipéptido.

39. Un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 29 - 30 para su uso en un procedimiento de modulación de angiogénesis en un mamífero que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho polipéptido.

40. Un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 29 - 30 para su uso en un procedimiento de inhibición del crecimiento de tumor caracterizado por la angiogénesis no deseada en un mamífero que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho polipéptido.

41. Una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 29 - 30 y un agente quimioterapéutico para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer en un mamífero que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho polipéptido y agente quimioterapéutico.

42. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41 en el que el agente quimioterapéutico es al menos uno de entre 5-FU y Taxotere.

43. Un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 29 - 30 para su uso en un procedimiento de modulación de al menos uno de entre permeabilidad vascular o fuga de plasma en un mamífero que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho polipéptido.

44. Un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 29 - 30 para su uso en un procedimiento de tratamiento de al menos uno de entre enfermedad neovascular ocular, obesidad, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerosis, enfermedad inflamatoria, trastornos inflamatorios, aterosclerosis, endometriosis, enfermedad neoplásica, enfermedad relacionada con los huesos, o psoriasis en un mamífero que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho polipéptido.