Procedimiento para sintetizar un polipéptido deseado de fórmula:

aaNH2-Q-aax-aay-W-aaCOOH en la que Q y W indican cada uno la presencia opcional de uno o más restos de aminoácidos adicionales, aaNH2 indica el resto de aminoácido con terminal N del polipéptido; aax y aay indican los restos de aminoácidos adyacentes internos, que presentan las cadenas laterales x e y, respectivamente, y en la que aay es un resto de aminoácido no especificado ribosómicamente y aaCOOH indica el resto de aminoácido con terminal C del polipéptido; comprendiendo el procedimiento: (A) ligar un primer péptido que presenta la fórmula: aaNH2-Q-aax-COSR, en la que R es cualquier grupo compatible con el grupo tioéster, a un segundo péptido que presenta la fórmula: Cys-W-aaCOOH, para formar así el polipéptido: aaNH2-Q-aaX-Cys-W-aaCOOH; y (B) incubar dicho polipéptido en presencia de un reactivo Raa-X, en el que Raa-X se selecciona de entre el grupo constituido por X-CH2COOH, X-(CH2)2COOH, X-(CH2)-C(O)NH2, X-CH2OH, X-CHOHCH3, X-CH2CHOHCH3, X-CH2CH2OH, X-(CH2)2NH-GP, X-CH2NH-C(NH2)2, X-(CH2)2NH-C(NH2)2, X-CH2CH3, X-CH2φ, X-φ-OH (para), X-CH2φ-OH (para), X-CH2φ-OPO3 (para), X-CH2-φ-(OH)2 (meta para), X-CH(COOH)2, X-CH2-IM-GP, X-CH-(CH3)2, X-CH2CH-(CH3)2, X-CH(CH3)-CH2-CH3, X-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3, en la que X es I o Br, y X-φ, en la que X es F, y X-CH2-IN, en la que X es F, I o Br, en la que φ indica un grupo bencilo, IN indica un grupo indol, IM indica un grupo imidazol y GP indica un grupo protector; siendo dicha incubación en condiciones suficientes para formar dicho polipéptido deseado

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para ampliar la técnica de la ligación química natural con el fin de permitir el enlace de una gama más amplia de péptidos, polipéptidos, mediante un enlace amida. Se dan a conocer los procedimientos y las utilizaciones para dichas proteínas y proteínas derivadas.

Antecedentes de la invención

Durante los últimos 30 años, la atención médica se ha concentrado de manera creciente en la posibilidad de utilizar proteínas producidas de forma natural como fármacos terapéuticos para el tratamiento de las enfermedades.

Las técnicas de ADN recombinante se han convertido en el procedimiento principal para la producción comercial de muchos polipéptidos y proteínas debido a las grandes cantidades que pueden producirse en bacterias y otras células hospedadoras. La producción de proteínas recombinantes implica transfectar o transformar las células hospedadoras con ADN que codifica la proteína exógena deseada y el crecimiento de las células en condiciones que favorecen la expresión de la proteína recombinante. E. coli y la levadura resultan preferidas como hospedadores porque puede hacerse que produzcan proteínas recombinantes a valores altos (véase, la patente US nº 5.756.672 (Builder et al.).

Se han publicado numerosas patentes US con respecto a la expresión bacteriana general de proteínas codificadas por ADN recombinante (véase, por ejemplo, las patentes US nº 4.565.785; nº 4.673.641; nº 4.738.921; nº 4.795.706; nº 4.710.473). Desgraciadamente, la utilización de técnicas de ADN recombinante no se ha logrado en todos los casos. En algunas condiciones, determinadas proteínas heterólogas expresadas en grandes cantidades en hospedadores bacterianos precipitan dentro de las células en agregados densos, reconocidos como puntos brillantes, visibles dentro de la membrana de las células al microscopio de contraste de fase. Estos agregados de proteínas precipitadas se denominan "cuerpos refractantes", y pueden constituir una parte significativa de las proteínas totales de la célula (Brems et al., Biochemistry (1985) 24: 7662).

La recuperación de las proteínas de estos cuerpos ha presentado numerosos problemas, tales como la separación de la proteína encajada dentro de la célula a partir del material celular y de las proteínas que lo alojan, y cómo recuperar las proteínas del cuerpo de inclusión en forma biológicamente activa. Para artículos generales de revistas sobre cuerpos refractantes véase Marston, anteriormente, Mitraki y King, Bio/Technology, 7: 690 (1989); Marston y Hartley, Methods in Enzymol., 182: 264-276 (1990); Wetzel, "Protein Aggregation In Vivo: Bacterial Inclusion Bodies and Mammalian Amyloid," en Stability of Protein Pharmaceuticals: In Vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization, Ahern y Manning (Eds.) (Plenum Press, 1991); y Wetzel, "Enhanced Folding and Stabilization of Proteins by Suppression of Aggregation In Vitro and In Vivo," en Protein Engineering-A Practical Approach; Rees, A. R. et al. (Eds.) (IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1991). Resulta por lo tanto necesaria una vía alternativa de producción de proteínas bioactivas.

Una alternativa a la producción recombinante de proteínas implica la utilización de los principios de la química orgánica para sintetizar proteínas. Los procedimientos existentes para la síntesis química de proteínas incluyen la síntesis en fase sólida paso a paso, y la condensación del fragmento ya sea en solución o en fase sólida. La síntesis en fase sólida clásica paso a paso de Merrifield implica el enlace covalente de un aminoácido correspondiente al aminoácido del terminal carboxi de la cadena peptídica deseada a un soporte sólido y la ampliación de la cadena polipeptídica hacia extremo amino por acoplamiento paso a paso de los derivados de aminoácidos activados que tienen grupos carboxilo activados. Después de la terminación del ensamblado de la cadena peptídica unida en fase sólida totalmente protegida, el enlace covalente en fase sólida de péptido se escinde por la química adecuada y los grupos protectores se eliminan para dar el producto polipéptido.

Existen desgraciadamente muchos inconvenientes para el procedimiento de síntesis en fase sólida paso a paso, incluyendo la formación de la fase sólida unida por productos que proceden de la reacción incompleta en las etapas de acoplamiento y desprotección en cada ciclo. Cuanto mayor es la cadena peptídica, mayor es el reto para obtener productos de alta pureza bien definidos. La síntesis de proteínas y polipéptidos grandes por esta vía es una tarea extensa y laboriosa.

El método de condensación de fragmentos en fase sólida (conocido también como condensación de segmentos) se diseñó para superar las dificultades en la obtención de polipéptidos largos por el procedimiento de síntesis paso a paso en fase sólida. El procedimiento de condensación de segmentos implica la preparación de varios segmentos peptídicos por el procedimiento de síntesis paso a paso en fase sólida, seguido de escisión de la fase sólida y purificación de estos segmentos protegidos al máximo. Los segmentos protegidos se condensan uno a uno al primer segmento, que está unido a la fase sólida. Con frecuencia, sin embargo, se encuentran dificultades técnicas en muchas de las etapas de condensación de segmentos en fase sólida. Véase E. Atherton et al.,"Solid Phase Fragment Condensation - The Problems", en Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis 11-25 (R. Epton, et al., 1990). Por ejemplo, la utilización de grupos protectores en segmentos para bloquear reacciones de enlace indeseadas puede hacer frecuentemente que los segmentos protegidos poco solubles, interfieran en la activación eficaz del grupo carboxilo. La solubilidad limitada de los segmentos protegidos también puede interferir con la purificación de los segmentos protegidos. Véase K. Akaji et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 33:184-102 (1985). Los segmentos protegidos son difíciles de caracterizar con respecto a la pureza, la estructura covalente, y no son adecuados para ESMS analítica de alta resolución (espectrometría de masas con electroatomización) (basada en la carga). La racemización del resto del terminal C de cada segmento peptídico activado es también un problema, excepto si el enlace se realiza en restos de glicina. Por otra parte, la escisión del polipéptido unido a la fase sólida, completamente ensamblado procedente de la fase sólida y la eliminación de los grupos protectores frecuentemente pueden requerir procedimientos químicos enojosos y prolongados tiempos de reacción que producen la degradación del polipéptido completamente ensamblado.

La condensación de segmentos puede realizarse en solución en lugar de en fase sólida. Véase H. Muramatsu et al., Biochem. and Biophys. Res. Commn. 203 (2): 1113-1139 (1994). Sin embargo, la condensación de segmentos en solución requiere la purificación de segmentos antes de la ligación así como la utilización de grupos protectores en una gama de diferentes grupos funcionales de cadena lateral para prevenir múltiples reacciones laterales indeseadas. Además, la ligación en solución no permite la fácil purificación y las etapas de lavado proporcionadas por las ligaciones en fase sólida. Además, las limitaciones con respecto a la solubilidad de segmentos peptídicos protegidos y los productos de reacción intermedios de péptidos protegidos empeoran.

La ligación química de segmentos peptídicos se ha explorado con el fin de resolver los problemas de solubilidad encontrados frecuentemente con péptidos protegidos al máximo. La ligación química implica la formación de un enlace covalente selectivo entre un primer componente químico y un segundo componente químico. Los grupos funcionales exclusivos, interreactivos presentes en el primer y segundo componentes pueden utilizarse para realizar la reacción de ligación quimioselectiva. Por ejemplo, la ligación química de péptidos y polipéptidos implica la reacción quimioselectiva de segmentos de péptidos o polipéptidos que son portadores de restos de aminoácido con terminal C y terminal N, exclusivos, interreactivos. Se han utilizado varias químicas diferentes con este fin, cuyos ejemplos incluyen la ligación química natural (Dawson et al., Science (1994), 266: 776-779; Kent et al., documento WO 96/3478; Kent et al., documento WO 98/28434), ligación química formadora de oxima (Rose, et al., J. Amer. Chem. Soc. (1994), 116:30-34), ligación formadora de tioéster... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para sintetizar un polipéptido deseado de fórmula:

aaNH2-Q-aax-aay-W-aaCOOH

en la que Q y W indican cada uno la presencia opcional de uno o más restos de aminoácidos adicionales, aaNH2 indica el resto de aminoácido con terminal N del polipéptido; aax y aay indican los restos de aminoácidos adyacentes internos, que presentan las cadenas laterales x e y, respectivamente, y en la que aay es un resto de aminoácido no especificado ribosómicamente y aaCOOH indica el resto de aminoácido con terminal C del polipéptido; comprendiendo el procedimiento:

(A) ligar un primer péptido que presenta la fórmula: aaNH2-Q-aax-COSR, en la que R es cualquier grupo compatible con el grupo tioéster, a un segundo péptido que presenta la fórmula: Cys-W-aaCOOH, para formar así el polipéptido: aaNH2-Q-aaX-Cys-W-aaCOOH; y

(B) incubar dicho polipéptido en presencia de un reactivo Raa-X, en el que Raa-X se selecciona de entre el grupo constituido por X-CH2COOH, X-(CH2)2COOH, X-(CH2)-C(O)NH2, X-CH2OH, X-CHOHCH3, X-CH2CHOHCH3, X-CH2CH2OH, X-(CH2)2NH-GP, X-CH2NH-C(NH2)2, X-(CH2)2NH-C(NH2)2, X-CH2CH3, X-CH2φ, X-φ-OH (para), X-CH2φ-OH (para), X-CH2φ-OPO3 (para), X-CH2-φ-(OH)2 (meta para), X-CH(COOH)2, X-CH2-IM-GP, X-CH-(CH3)2, X-CH2CH-(CH3)2, X-CH(CH3)-CH2-CH3, X-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3, en la que X es I o Br, y X-φ, en la que X es F, y X-CH2-IN, en la que X es F, I o Br, en la que φ indica un grupo bencilo, IN indica un grupo indol, IM indica un grupo imidazol y GP indica un grupo protector;

siendo dicha incubación en condiciones suficientes para formar dicho polipéptido deseado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que R es un grupo arilo, bencilo o alquilo.