PÉPTIDOS ESPECÍFICOS PARA LAS METÁSTASIS Y SUS APLICACIONES EN DIAGNÓSTICO Y TERAPÉUTICAS.

Un péptido capaz de fijarse selectivamente a células metastásicas,

preferiblemente células de metástasis hepáticas humanas, que tiene el motivo de secuencia LRS, una longitud de 6 a 100 aminoácidos y que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el conjunto que se compone de: ARPGLRS (SEQ ID NO. 1), MRYALRS (SEQ ID NO. 2), LRPGLRS (SEQ ID NO. 3), LRSGSGS (SEQ ID NO. 4), GIYRLRS (SEQ ID NO. 6), GVYSLRS (SEQ ID NO. 7), LRSGRGS (SEQ ID NO. 96), RREGLRS (SEQ ID NO. 110), SWYTLRS (SEQ ID NO. 111), LAYRLRS (SEQ ID NO. 113), LTYRLRS (SEQ ID NO. 115), VRPGLRS (SEQ ID NO. 117) y LRSGRGS (SEQ ID NO. 119)

ESTADO DE LA TÉCNICA DEL INVENTO

El presente invento comprende unos péptidos que son altamente específicos para células metastásicas de tumores, en particular células de metástasis hepáticas, y su aplicación en los sectores de diagnóstico y terapéuticos.

ANTECEDENTES TÉCNICOS DEL INVENTO

Tumor y metastatización

La tumorigénesis es un proceso de múltiples etapas, en el cual algunas células evolucionan progresivamente hacia la malignidad. El conocimiento actual en el campo de la neoplasia subraya que el cáncer es una enfermedad inducida por cambios dinámicos del genoma. A través de estas variaciones, las células de tumores adquieren independencia con respecto de diversos mecanismos que controlan las funciones fisiológicas del organismo. Como consecuencia de esto, ellas resultan capaces de (1) crecer continuamente, (2) inducir el reclutamiento de células endoteliales para la formación de nuevos vasos sanguíneos y (3) colonizar órganos diferentes del de origen.

La capacidad proliferativa de las células tumorales es debida fundamentalmente a dos mecanismos. En primer lugar, mientras que las células normales necesitan unos factores mitogénicos para cambiar desde un estado quieto a un estado activo, en proliferación, en las células tumorales, las mutaciones y/o la sobreexpresión de receptores de factores de crecimiento pueden inducir la cascada de proliferación independientemente de la presencia de un ligando. Además, en muchos casos, las células tumorales adquieren la capacidad de sintetizar unos factores solubles, a los que ellas son sensibles. Así, se establece una estimulación autocrina, que aumenta aún más el crecimiento de un tumor. El otro fenómeno de desregulación del crecimiento de las células en tumores es la resistencia a una apóptosis (muerte celular programada). Este mecanismo, fundamental en el crecimiento y la remodelación de órganos durante el desarrollo fisiológico, es inducido también en el caso de daños no reversibles en el genoma, para evitar la expansión de una población de células aberrantes. Algunas células, sin embargo, pueden escapar de esta clase de protección y se vuelven independientes, favoreciendo de esta manera la propagación de mutaciones y la consiguiente progresión neoplásica.

Una masa tumoral primordial está constituida por un pequeño número de células, y no podría desarrollarse por encima de un diámetro de 2 mm si no es apoyada por una alimentación adecuada y el soporte con oxígeno. Esta es la fase en la que una angiogénesis, es decir la formación de nuevos capilares sanguíneos a partir de vasos sanguíneos previamente existentes, es estimulada en alto grado por las células tumorales propiamente dichas. El desequilibrio entre señales positivas y negativas de la regulación de una angiogénesis conduce a la neoformación de una red vascular que penetra en, y alimenta a, la masa tumoral que está proliferando activamente. Los vasos sanguíneos de un tumor, además de proporcionar la nutrición, tienen la función de transportar células malignas hacia otros distritos del cuerpo.

La progresión de un tumor evoluciona hacia una etapa de irreversibilidad, cuya particularidad característica es una metastatización. En este proceso, unas células pioneras escapan desde la masa tumoral primaria. Unas vez que han entrado dentro de los capilares que rellenan el tumor, ellas llegan al torrente sanguíneo, que las transporta a unas regiones distantes del sitio de derivación, en donde ellas darán origen a un tumor secundario.

El desarrollo de una metástasis representa un suceso biológico complejo, relacionado con las interacciones entre unos factores intrínsecos del organismo (condiciones generales, integridad de la respuesta inmunitaria) y unas características específicas de las células tumorales (localización, tamaño y modelos histológicos). Desde el sitio primario microscópico, la difusión de células tumorales es primeramente local, pasando por una diseminación centrífuga. Por producción de unas proteasas que degradan a las conexiones intercelulares y a la matriz extracelular, las células tumorales invaden a unas estructuras anatómicas y a unos tejidos que son escasamente resistentes (tejido graso, vainas nerviosas, médula ósea).

Un primer obstáculo para la difusión metastásica es ofrecido por la presencia de unas estructuras relativamente impenetrables, tales como las cápsulas de órganos, un cartílago o periostio, la meninge. Debido a la dificultad de ir más allá de estos límites, una metastatización en sitios distantes debe de seguir unas etapas que se pueden resumir de la siguiente manera: (1) entrada en la red capilar de un tumor por un mecanismo denominado “intravasación”, (2) transporte a través del torrente sanguíneo, (3) reconocimiento específico del endotelio de destino, (4) salida desde el capilar por un mecanismo denominado “extravasación” y (5) desarrollo de una metástasis, soportado por una angiogénesis activa.

El éxito de una diseminación depende de las características anatómicas y de los factores hemodinámicos del organismo anfitrión, y de las interacciones que pueden experimentar las células tumorales con el endotelio que reviste a los vasos sanguíneos. Las rutas de difusión más corrientes son los vasos (linfáticos y sanguíneos) y las cavidades celomáticas. Los vasos linfáticos son penetrados con bastante facilidad, a causa de la ausencia de una lámina basal. Así, las células tumorales pueden transitar con facilidad dentro de los nódulos linfáticos, antes de entrar en el sistema venoso a través de las conexiones linfáticas y venosas. El trasporte dentro de los vasos puede afectar al sistema tanto arterial como venoso, incluso aunque la invasión venosa es más corriente, puesto que la circulación venosa recoge el flujo que sale desde ciertos órganos. Ejemplos típicos son la vena sistémica para el pulmón y la vena porta para el hígado. La diseminación trans-celomática concierne en vez de ello a la cavidad pleural del pecho y a los espacios peritoneales del abdomen y de la pelvis. El sitio más corrientemente implicado es el peritoneo, en donde, después de verter líquidos debido a la obstrucción de las venas hepáticas, las células tumorales son recogidas en el fluido ascítico. Los cánceres de estómago, colón, páncreas y ovario adoptan usualmente este sistema.

Las células metastásicas de tumores expresan unos específicos determinantes moleculares que contribuyen de diversas maneras a la metástasis propiamente dicha. La distribución de una metástasis no es casual, pero cada tumor tiene unas direcciones preferentes, esto es conocido como órgano-tropismo. El hígado es un órgano objetivo para tumores colorrectales; los huesos lo son para tumores de próstata y ovarios; y los pulmones lo son para tumores de testículos, huesos y mamas. Los pulmones y el hígado, debido a su función de filtración y a la presencia de un enorme número de capilares, pueden recibir metástasis virtualmente a partir de cualquier órgano y también envían colonias de tumores, principalmente hacia el cerebro y los huesos.

El hígado es un sitio corriente para lesiones metastásicas. La razón de ello ha de ser buscada e investigada en la organización funcional y estructural del distrito hepático. La vena porta, que evacua la sangre hacia las vísceras abdominales, representa el conducto a través del cual las células que proceden de los tumores primarios son vehiculadas hacia el hígado. La adhesión de células tumorales circulantes al endotelio de un hígado es una etapa crítica para el comienzo de una metastatización. Las metástasis hepáticas se desarrollan como una consecuencia de la invasión del parénquima hepático por estos trombos de células.

El alto volumen de un flujo sanguíneo hepático (aproximadamente un 25 % del flujo cardíaco), y la anatomía microscópica particular de los sinusoides son los factores que favorecen la diseminación hepática. El tumor primario puede ser localizado en el tracto gastrointestinal, es decir en el colon, el recto, el estómago, el páncreas, el tracto biliar y el vientre. A éstos, se les pueden añadir también los tumores de las mamas y de los pulmones.

Tumor colorrectal

Existen diferentes clases de clasificaciones que, en general, dividen la evolución progresiva de la enfermedad en unas etapas caracterizadas por el grado de invasión del cuerpo por ese tumor. Las clasificaciones de Dukes y MAC (acrónimo de Modified Astler-Coller = Astler-Coller modificada), propuestas al comienzo... [Seguir leyendo]

1. Un péptido capaz de fijarse selectivamente a células metastásicas, preferiblemente células de metástasis hepáticas humanas, que tiene el motivo de secuencia LRS, una longitud de 6 a 100 aminoácidos y que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el conjunto que se compone de: ARPGLRS (SEQ ID NO. 1), MRYALRS (SEQ ID NO. 2), LRPGLRS (SEQ ID NO. 3), LRSGSGS (SEQ ID NO. 4), GIYRLRS (SEQ ID NO. 6), GVYSLRS (SEQ ID NO. 7), LRSGRGS (SEQ ID NO. 96), RREGLRS (SEQ ID NO. 110), SWYTLRS (SEQ ID NO. 111), LAYRLRS (SEQ ID NO. 113), LTYRLRS (SEQ ID NO. 115), VRPGLRS (SEQ ID NO. 117) y LRSGRGS (SEQ ID NO. 119).

2. Un péptido de la reivindicación 1, que es un péptido cíclico.

3. Un péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende por lo menos un aminoácido modificado, un aminoácido no usual y/o un aminoácido en la conformación D.

4. Un conjugado que comprende por lo menos un péptido capaz de fijarse selectivamente a células metastásicas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y por lo menos una molécula.

5. Un conjugado de la reivindicación 4, en el que dicha por lo menos una molécula se selecciona entre un fármaco, un agente quimioterapéutico, un radioisótopo, un agente anti-apoptótico, un agente antiangiogénico, una hormona, una citocina, un agente citotóxico, un agente citostático, un péptido, una proteína, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab, un virus, un bacteriófago, una bacteria, un liposoma, una micropartícula, una perla magnética, una nanopartícula, una célula de levadura y una célula de mamífero, en el que

dicho agente anti-angiogénico se selecciona preferiblemente entre el conjunto que consiste en tromboespondina, angiostatina, el factor derivado de epitelio pigmentado, angiotensina, péptidos de laminina, péptidos de fibronectina, agentes inhibidores del inhibidor de plasminógeno, agentes inhibidores de metaloproteinasa tisular, interferones, interleucina 12 (IL-12), el factor de plaquetas 4, IP-10, 2-metoxiestradiol, la proteína relacionada con proliferina, carboxiamidotriazol, CM 101, marimastat, polisulfato de pentosán, angiopoyetina 2, interferón-alfa, herbimicina A, PNU145156E, un fragmento de prolactina de 16K, linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteína, TNP-470, endostatina, paclitaxel, docetaxel, poliaminas, un agente inhibidor de proteasomas, un agente inhibidor de cinasas, un péptido de señalización, accutin, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, el factor de plaquetas 4 y minociclina,

dicho agente pro-apoptótico se selecciona preferiblemente entre el conjunto que consiste en etopósido, esfingomielina de ceramida, Bax, Bid, Bik; Bad, caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9, fas, ligando de fas, fadd, fap-1, tradd, faf, rip, reaper, apoptina, enzima convertidora de interleucina-2 y anexina V,

dicha citocina está seleccionada preferiblemente entre el conjunto que consiste en interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-5, IL10, IL-11, IL-12, IL-18, interferón gamma (IF-gamma), IF-alfa, IF-beta, el factor de necrosis de tumores alfa (TNFalfa), y GM-CSF (el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos) y

dicho virus está seleccionado preferiblemente entre un adenovirus, un retrovirus, un virus asociado con adeno y un lentivirus.

6. Un conjugado de la reivindicación 4, en el que dicha por lo menos una molécula es un agente de diagnóstico destinado a un uso in vivo, seleccionado preferiblemente entre iones paramagnéticos o radioisótopos, o para ensayos in vitro.

7. Un ácido nucleico que codifica un péptido capaz de fijarse selectivamente a células metastásicas, que tiene el motivo de secuencia LRS, una longitud de 6 a 100 aminoácidos de secuencia y comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el conjunto que se compone de: ARPGLRS (SEQ ID NO. 1), MRYALRS (SEQ ID NO. 2), LRPGLRS (SEQ ID NO. 3), LRSGSGS (SEQ ID NO. 4), GIYRLRS (SEQ ID NO. 6), GVYSLRS (SEQ ID NO. 7), LRSGRGS (SEQ ID NO. 96), RREGLRS (SEQ ID NO. 110), SWYTLRS (SEQ ID NO. 111), LAYRLRS (SEQ ID NO. 113), LTYRLRS (SEQ ID NO. 115), VRPGLRS (SEQ ID NO. 117) y LRSGRGS (SEQ ID NO. 119).

8. Una formulación que comprende por lo menos un péptido capaz de fijarse específicamente a células metastásicas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

9. Una formulación de la reivindicación 8, en la que dicho por lo menos un péptido está conjugado con un fármaco, preferiblemente con un agente terapéutico capaz de tener un efecto citotóxico, citostático, proapoptótico o anti-angiogénico sobre células de metástasis hepáticas, un agente alquilante, un anti-metabolito o un antibiótico.

10. Una formulación de la reivindicación 8, en la que dicho por lo menos un péptido está conjugado con un agente de diagnóstico destinado a un uso in vivo o para ensayos in vitro.

11. Una formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, que es una formulación farmacéutica que incluye preferiblemente por lo menos un vehículo y/o un excipiente aceptable.

12. Uso de un péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la producción de una formulación de diagnóstico destinada a un uso in vivo o para ensayos in vitro para la localización de células

5 metastásicas, preferiblemente células de metástasis hepáticas, en un individuo con un tumor, particularmente con un tumor de colon.

13. Uso de un péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o de un ácido nucleico de la reivindicación 7, para la producción de un medicamento destinado a la terapia antitumoral en un individuo portador de un tumor.

10 14. Un procedimiento in vitro para obtener un péptido capaz de fijarse selectivamente a células metastásicas, preferiblemente células metastásicas hepáticas, que se derivan particularmente de un tumor colorrectal primario, que tiene un motivo de secuencia LRS y que tiene una longitud de 6 a 100 aminoácidos, en que el procedimiento comprende (1) poner en contacto la célula metastásica o un tejido que contiene células metastásicas con una pluralidad de fagos, en que cada fago presenta secuencias de péptidos heterólogos incorporadas dentro de una proteína cápsida, (2) retirar los fagos que no se fijan a las células o a los tejidos, (3) aislar los fagos que se fijan a la célula o al tejido, y opcionalmente (4) identificar las secuencias de péptidos heterólogos.

15. Un procedimiento in vitro de la reivindicación 14, en el que dicho péptido comprende por lo menos una secuencia seleccionada entre el conjunto que se compone de: ARPGLRS (SEQ ID NO. 1), MRYALRS (SEQ ID NO. 2), LRPGLRS (SEQ ID NO. 3), LRSGSGS (SEQ ID NO. 4), GIYRLRS (SEQ ID NO. 6), GVYSLRS (SEQ ID NO. 7), LRSGRGS (SEQ ID NO. 96), RREGLRS (SEQ ID NO. 110), SWYTLRS (SEQ ID NO. 111), LAYRLRS (SEQ ID NO. 113), LTYRLRS (SEQ ID NO. 115), VRPGLRS (SEQ ID NO. 117) y LRSGRGS (SEQ ID NO. 119).