MÉTODOS Y COMPUESTOS PARA TRATAR LA DIABETES.

Uso de una cantidad eficaz del tetrámero de transtiretina para la fabricación de un medicamento para tratar la diabetes de tipo I o para prevenir la diabetes de tipo I en un paciente con diabetes de tipo I o en un paciente en riesgo de desarrollar diabetes de tipo I

La presente invención está relacionada con métodos y productos destinados a tratar la diabetes mellitus y con métodos para identificar compuestos que puedan servir para tratar dicha dolencia. Antecedentes de la invención La transtiretina (TTR) es una proteína tetramérica de subunidades idénticas de 14 kDa, que se sintetiza sobre todo en el hígado y en el plexo coroideo del cerebro (1). Se trata de una proteína de transporte de la tiroxina y, en asociación con la proteína enlazante del retinol, de dicho retinol. La TTR presenta un equilibrio complejo entre diferentes estructuras cuaternarias en suero (2), aunque existe principalmente como tetrámero en concentraciones de 160-380 mg/l, con sólo una pequeña cantidad de monómero de TTR en vivo en individuos normales (3, 4). En la diabetes de tipo 1 (DT1) existe una destrucción específica de la célula ß pancreática secretora de insulina. Aunque los mecanismos moleculares exactos que están detrás de la destrucción de la célula ß no son conocidos, se ha demostrado que el suero de nuevos pacientes diagnosticados de DT1 aumenta la actividad de los canales de Ca 2+ de tipo L dependientes del voltaje en células ß (8). Esto desemboca en aumentos no fisiológicos en la [Ca 2+ ]i en el momento de la despolarización y, por ende, en la apoptosis de la célula ß, efectos que pueden evitarse mediante bloqueadores del canal de Ca 2+ . Así, la apoptosis inducida por Ca 2+ puede estar implicada en la compleja reacción autoinmune asociada a la DT1. La cuestión básica ha sido determinar qué factor del suero de pacientes con DT1 es responsable de los cambios no fisiológicos en la [Ca 2+ ]. Recientemente, hemos identificado uno de estos factores: la apolipoproteína CIII (apoCIII) (9). La apoCIII aparece en mayor concentración en suero de pacientes con DT1, y provoca tanto un aumento de la [Ca 2+ ]i como la muerte de la célula ß. Los efectos del suero de pacientes con DT1 y de la apoCIII sobre la [Ca 2+ ] y la apoptosis de la célula ß se suprimen en presencia de un anticuerpo contra la apoCIII. A la hora de considerar el desarrollo de la DT1, es importante señalar que los niveles de proinsulina pueden aparecer elevados en hermanos de pacientes con DT1, independientemente de la identidad HLA (10). Esto puede reflejar un deterioro de la función de la célula ß antes de la aparición de la DT1. También cabe destacar que la concentración en suero del tetrámero de TTR es menor en niños con DT1 (11-13). En el presente documento se demuestra que el tetrámero de TTR no sólo constituye un componente funcional en el acoplamiento estímulo-secreción en la célula ß pancreática normal, sino que también ayuda a conservar la integridad de dicha célula ß. También demostramos que la concentración de TTR total disminuye en la DT1, mientras que la concentración de la estructura monomérica aumenta. Una observación importante fue que el monómero no constituye ni un componente funcional en el acoplamiento estímulo-secreción en la célula ß pancreática normal, ni tampoco conserva la integridad de la célula ß. Por este motivo, es posible que la conversión de la estructura tetramérica de la TTR a la forma monomérica pueda ser uno de los primeros e importantes pasos asociados con el desarrollo de los fallos / la destrucción de la célula ß en la DT1. Resumen de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona tetrámeros de TTR para su uso en el tratamiento o en la prevención de la diabetes de tipo I en un paciente diabético de tipo I o en un paciente con riesgo de desarrollar la diabetes de tipo I. En otra modalidad, el tetrámero de TTR aislado se suministra en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional, la presente invención ofrece métodos para identificar compuestos de cara al tratamiento o la prevención de la diabetes de tipo I, que comprenden poner en contacto las células ß pancreáticas con uno o más compuestos de prueba e identificar aquellos compuestos que limitan la reducción de tetrámeros de TTR en las células ß pancreáticas en comparación con la muestra de control, en los que dichos compuestos son candidatos para el tratamiento o la prevención de la diabetes de tipo I. En una modalidad adicional, el método consta, además, de la preparación de los compuestos que se han identificado como elementos que evitan o limitan la reducción de tetrámeros de TTR. En otro aspecto, la presente invención ofrece métodos para predecir el riesgo de fallo de la célula ß pancreática en un paciente, que constan de la determinación de uno o más de los siguientes elementos en las células beta pancreáticas: (a) una cantidad de transtiretina monomérica relativa a las células ß pancreáticas testigo; y/o (a) una cantidad de transtiretina tetramérica relativa a las células ß pancreáticas testigo; 2   donde las mediciones efectuadas en (a) y (b) se utilizan para determinar el riesgo de fallo de la célula ß pancreática. En otro aspecto, la presente invención ofrece métodos para predecir el riesgo de padecer diabetes de tipo I en un paciente, que constan de la determinación de uno o más de los siguientes elementos en las células beta pancreáticas de dicho paciente: (a) una cantidad de transtiretina monomérica relativa a las células ß pancreáticas testigo; y/o (a) una cantidad de transtiretina tetramérica relativa a las células ß pancreáticas testigo; donde las mediciones efectuadas en (a) y (b) se utilizan para determinar el riesgo de padecer diabetes de tipo I en el paciente. Breve descripción de las figuras Figura 1. Efectos sobre la [Ca 2+ ]i y las corrientes de Ca 2+ dependientes del voltaje. A, C: Células incubadas con TTR total. B, D: Células incubadas con el monómero. En A y B, el aumento en [Ca 2+ ]i se muestra cuando las células son estimuladas con glucosa (A, n=48, 98 y 64, respectivamente para células de control, y 46, 113 y 82 para células tratadas con TTR. B, n=50, 50 y 56, respectivamente para células de control, y 73, 47 y 74, respectivamente para las células tratadas con monómero de TTR). En C y D, el aumento delta en [Ca 2+ ]i se muestra cuando las células son despolarizadas con KCl (C, n=48, 97 y 71, respectivamente para células de control, y 44, 111 y 90 para células tratadas con TTR. D, n=83, 83 y 65, respectivamente para células de control, y 83, 60 y 83 respectivamente para las células tratadas con monómero de TTR). E, ejemplos detrazos de corriente de Ca 2+ en célula completa, generados por un impulso de voltaje de despolarización (100 ms) hasta -20 mV desde un potencial basal de -70 mV, a partir de una célula de control (trazo superior) y una célula incubada con TTR (trazo inferior). F, relaciones corriente-voltaje de Ca 2+ de célula completa en células ß pancreáticas en presencia y en ausencia de TTR. Las células ß tratadas con TTR (n=45) muestran corrientes de Ca 2+ mayores que las células de control (n=50) cuando son despolarizadas hasta -20 mV.(**p<0,01, ***p<0,001). Figura 2. Efectos de la TTR total sobre la secreción de insulina. La liberación de insulina fue medida en células ß previamente incubadas con A, TTR a 50 mg/l (n=5); B, a 100 mg/l (n=3), y C, a 150 mg/l (n=5). D, trazo representativo (n=3) de liberación de insulina en islotes humanos expuestos a TTR a 150 mg/l. Liberación de insulina de A-C expresada como AUC (área bajo la curva) en E, secreción basal, y en F; secreción estimulada por glucosa (*p<0,05, **p<0,01). Figura 3. Perfil de la TTR en SDS-PAGE. TTR comercial sometida a HPLC, con una columna Vydac C18, acetonitrilo (ACN) en 0,1% de TFA; gradiente de 20- 60% en 30 minutos; las fracciones 1, 2 y 3 y se recogieron y se sometieron a SDS-PAGE; STD hace referencia a la TTR comercial antes de la HPLC. Figura 4. SDS-PAGE de suero de adultos y niños con DT1 y de testigos sanos, y efecto de la TTR total y del monómero de TTR ± apoCIII en la muerte celular. A. Cinco sueros DT1 (D) de adultos y un suero de control (C). B. Suero de dos DT1 (D) y dos sueros de control (C). La banda de la forma monomérica de la TTR está marcada con una flecha. Tanto en A como en B se incluyeron calles con TTR comercial y con un marcador de rango amplio (M). Análisis por FACS de células ß pancreáticas expuestas a C. TTR total o monómero de TTR. TTR +/- (apoCIII o apoCIII solo [n=5]). La muerte celular se expresa como el porcentaje de 10.000 células contadas. Descripción detallada de la invención En el marco de esta solicitud, a menos que se especifique lo contrario, las técnicas utilizadas pueden encontrarse en cualquiera de las diversas referencias bien conocidas, como por ejemplo: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein... [Seguir leyendo]

1. Uso de una cantidad eficaz del tetrámero de transtiretina para la fabricación de un medicamento para tratar la diabetes de tipo I o para prevenir la diabetes de tipo I en un paciente con diabetes de tipo I o en un paciente en riesgo de desarrollar diabetes de tipo I. 2. Uso según la reivindicación 1, en el que el tetrámero de transtiretina está sustancialmente desprovisto de monómeros de transtiretina. 3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el tetrámero de transtiretina comprende transtiretina de mamífero. 4. Uso según la reivindicación 3, en el que la transtiretina de mamífero es transtiretina humana. 5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se trata la diabetes de tipo I en un paciente con diabetes de tipo I. 6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se previene la diabetes de tipo I en un paciente en riesgo de desarrollar diabetes de tipo I. 7. Un método para identificar compuestos para el tratamiento o la prevención de la diabetes de tipo I, que comprende contactar las células ß pancreáticas con uno o más compuestos de prueba e identificar aquellos compuestos de prueba que limitan la reducción de tetrámeros de TTR en las células ß pancreáticas en comparación con la muestra de control, en el que dichos compuestos de prueba son compuestos candidatos para el tratamiento o la prevención de la diabetes de tipo I. 8. Método según la reivindicación 7, que además comprende la síntesis de los compuestos candidatos. 9. Método según la reivindicación 7, en el que las células ß pancreáticas son de un paciente con diabetes de tipo 1 o de un modelo animal de diabetes de tipo 1. 10. Método según la reivindicación 7, en el que las células ß pancreáticas son de ratones ob/ob. 11. Método para predecir el riesgo de fallo de la célula ß pancreática, que comprende detectar uno o más de los siguientes elementos en células beta pancreáticas, en el que dichas células se obtienen a partir de especies animales: (a) una cantidad de transtiretina monomérica relativa a las células ß pancreáticas control; y/o (b) una cantidad de transtiretina tetramérica relativa a las células ß pancreáticas control; en el que las mediciones efectuadas en (a) y (b) se utilizan para determinar un riesgo de fallo de la célula ß pancreática. 12. Método según la reivindicación 11, en el que el método se emplea para predecir el riesgo de desarrollar diabetes de tipo I. 13. Método para predecir el riesgo de diabetes de tipo I en un paciente, que comprende la detección de uno o más de los siguientes elementos en las células beta pancreáticas, en el que dichas células se obtienen a partir de dicho paciente: (a) una cantidad de transtiretina monomérica relativa a las células ß pancreáticas control; y/o (b) una cantidad de transtiretina tetramérica relativa a las células ß pancreáticas control; en el que las mediciones efectuadas en (a) y (b) se utilizan para determinar el riesgo de padecer diabetes de tipo I en el paciente. 14. Tetrámero de transtiretina para su uso en el tratamiento o en la prevención de la diabetes de tipo I en un paciente con diabetes de tipo I o en un paciente en riesgo de desarrollar diabetes de tipo I. 13   15. Tetrámero de transtiretina para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el tetrámero de transtiretina comprende transtiretina humana. 14     16   17   18