Uso de un ácido nucleico que comprende un gen asociado a la diferenciación del melanoma (mda-7) para la preparación de una composición farmacéutica para invertir el fenotipo canceroso de una célula cancerosa en un sujeto,

en el que la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de cuello del útero, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer nasofaríngeo, una célula de cáncer de pulmón, una célula de osteosarcoma y una célula de cáncer de tejido conjuntivo

La presente solicitud es una solicitud de continuación en parte de la solicitud de EE.UU. nº de serie 08/696.573 presentada el 16 de junio de 1996, cuyo contenido se incorpora en la presente solicitud por referencia.

La invención desvelada en este documento se hizo con la financiación del gobierno bajo la subvención del NCI/NIH nº CA35675 del Departamento de Salud y Servicios Humanos. Por consiguiente, el gobierno de EE.UU. tiene ciertos derechos en la presente invención.

En toda la presente solicitud, diversas referencias se citan dentro de paréntesis. Las divulgaciones de estas publicaciones se incorporan en sus totalidades por este documento por referencia en la presente solicitud para describir más completamente el estado de la materia al que se refiere la presente invención. La mención bibliográfica completa de estas referencias puede encontrarse al final de cada serie de experimentos.

Antecedentes de la invención

El cáncer es un complejo proceso de múltiples factores y múltiples etapas que implica la expresión coordinada y la supresión de genes que funcionan de reguladores positivos y negativos de la oncogénesis (1-5). La estrategias de clonación directa basadas en la transferencia de un fenotipo transformante dominante o tumorigénico han identificado oncogenes de acción positiva (6-9). A diferencia, la detección y la clonación de genes que suprimen el fenotipo del cáncer han demostrado ser más difíciles y escurridizas (10-15). Un enfoque directo para aislar genes directamente implicados en la regulación del crecimiento y la diferenciación implica hibridación sustractiva entre bibliotecas de ADNc construidas a partir de células cancerosas activamente en crecimiento y bibliotecas de ADNc de células cancerosas inducidas para perder la capacidad proliferativa irreversiblemente y para diferenciarse terminalmente (13,14). Esta estrategia experimental se ha aplicado a células de melanoma humano inducidas para diferenciarse terminalmente mediante el tratamiento con interferón β (IFN-β) recombinante humano y mezereína (MEZ), produciendo la clonación de novedosos genes asociados a la diferenciación del melanoma (mda) no previamente descritos en bases de datos de ADN (13,14). Una función directa para los genes mda específicos en la mediación del control del crecimiento y el ciclo celular es evidente mediante la identificación y la clonación de mda-6 (13-16), que es idéntico al inhibidor ubicuo de cinasas dependientes de ciclinas p21 (17). La importancia de p21 en el control del crecimiento está muy bien documentada y este gen ha sido aislado independientemente, como WAF-1, CIP-1 y SDI-1, por varios laboratorios usando diferentes enfoques (18-20). Estos estudios indican que los genes específicos asociados al control proliferativo son inducidos y pueden contribuir a los procesos de detención del crecimiento y diferenciación terminal en células cancerosas humanas.

El gen mda-7 se clonó a partir de una biblioteca sustractiva de melanoma humano (HO-1) tratado con un inductor de la diferenciación (IFN-β más MEZ) (13,14). El ADNc de mda-7 tiene 1718 nucleótidos, y el principal marco de lectura abierto codifica una proteína novedosa de 206 aa con un Mr de 23,8 kDa (21). Estudios previos indican que mda-7 se induce en función de la detención del crecimiento y la inducción de la diferenciación terminal en células de melanoma humano (14,21). La expresión de mda-7 también establece inversamente una correlación con la progresión de melanoma, es decir, melanocitos humanos normales que crecen activamente expresan más mda-7 que células de melanoma humano metastásico (21). Además, el mda-7 es inhibidor del crecimiento hacia células de melanoma humano en ensayos de transfección transitoria y en células transformadas estables que contienen un gen mda-7 inducible por dexametasona (DEX) (21). Estos estudios indican que mda-7 puede contribuir a la fisiología de melanocitos y melanomas humanos, y este gen tiene propiedades supresoras del crecimiento cuando se expresa en exceso en células de melanoma humano.

El gen mda-7 también se describió en la solicitud de Tratado de Cooperación de Patente internacional nº PCT/US94/12160, fecha de presentación internacional, 24 de octubre de 1994 con publicación internacional nº WO95/11986, cuyo contenido se incorpora en la presente solicitud por referencia.

La presente invención informa que mda-7 es un potente gen supresor del crecimiento en células cancerosas de diverso origen que incluye mama, sistema nervioso central, cuello del útero, colon, próstata y tejido conjuntivo. Una inhibición en la formación de colonias se produce en células cancerosas que contienen defectos en sus genes p53 y/o de retinoblastoma (RB) o que carecen de la expresión de p53 y de RB. A diferencia, la expresión de mda-7 en células epiteliales mamarias humanas normales, fibroblastos de la piel humana y fibroblastos de embrión de rata induce cuantitativamente menos supresión del crecimiento que en células cancerosas. Cuando se expresa establemente en células de carcinoma de cuello del útero humano (HeLa) y de carcinoma de próstata (DU-145), mda-7 tiene un efecto negativo sobre las propiedades relacionadas con el crecimiento y la transformación. Los efectos de mda-7 sobre células HeLa son reversibles tras la derogación de la proteína MDA-7 mediante infección con un vector Ad5 genéticamente modificado que expresa un gen mda-7 antisentido. Estas observaciones indican que mda-7 es un novedoso gen supresor del crecimiento con una amplia gama de acciones inhibitorias en cánceres humanos que manifiestan diferentes defectos genéticos.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para invertir el fenotipo canceroso de una célula cancerosa introduciendo un ácido nucleico que incluye un gen asociado a la diferenciación del melanoma (mda-7) en la célula en condiciones que permitan la expresión del gen de manera que así se invierta el fenotipo canceroso de la célula. La presente invención también proporciona un procedimiento para invertir el fenotipo canceroso de célula cancerosa en un sujeto introduciendo el ácido nucleico anteriormente descrito en la célula cancerosa del sujeto.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que tiene una cantidad de un ácido nucleico que incluye un gen asociado a la diferenciación del melanoma (mda-7) eficaz para invertir el fenotipo canceroso de una célula cancerosa y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Efecto de la expresión de mda-7 sobre la formación de colonias resistentes a higromicina en células HeLa. Las células HeLa se transfectaron con 10 µg de vector pREP4 (vector del RSV), mda-7 se clonó en una orientación antisentido en el vector pREP4 (RSV-MDA-7-antisentido), o mda-7 se clonó en una orientación sentido en el vector pREP4 (RSV-MDA-7-sentido) y se seleccionó en medios que contenían 100 µg de higromicina.

Figura 2. Efecto de mda-7 antisentido sobre el crecimiento en monocapa de HeLa cl 1 del vector pREP4 y células HeLa cl 2 que expresan mda-7 (S). Se cultivaron células HeLa cl 1 (clon de HeLa transformado con el vector pREP4) y HeLa cl 2 (clon de HeLa que expresa mda-7) en ausencia o tras la infección con 10 unidades formadoras de placa/célula con un adenovirus de tipo 5 recombinante (Ad5) que expresa mda-7 antisentido [Ad.mda-7 (AS)]. Los resultados son el número de células promedio de muestras por triplicado que variaron ≤ 10%.

Figura 3. Efecto de mda-7 antisentido sobre la proteína complejante MDA-7 de alto peso molecular (HMC), la proteína MDA-7 y la proteína actina en células HeLa, HeLa cl 1 y HeLa cl 2. HeLa y HeLa cl 1 (clon de HeLa transformado con el vector pREP4) estaban sin infectar (-) o infectadas (+) con 10 unidades formadoras de placa/célula de Ad.mda-7 (AS) durante 96 h marcado con [35S]-metionina, y los niveles de las proteínas HMC, MDA7 y actina se determinaron por análisis de inmunoprecipitación. Para HeLa cl 2 (clon de HeLa que expresa mda-7), el efecto de la infección con 10 unidades formadoras de placa/ml de Ad.mda-7 (AS) sobre los niveles de proteína se determinó por análisis de inmunoprecipitación de lisados celulares marcados con [35S]-metionina después de +24, +48, +72 y +96 h. El efecto de la infección de células HeLa cl 2 con Ad5 mutante de control, H5dl 434, se determinó por análisis de inmunoprecipitación de lisados celulares marcados con [35S]-metionina 96 h después de la infección con 10 unidades formadoras de placa/célula.

Figuras... [Seguir leyendo]

1. Uso de un ácido nucleico que comprende un gen asociado a la diferenciación del melanoma (mda-7) para la preparación de una composición farmacéutica para invertir el fenotipo canceroso de una célula cancerosa en un sujeto, en el que la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de cuello del útero, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer nasofaríngeo, una célula de cáncer de pulmón, una célula de osteosarcoma y una célula de cáncer de tejido conjuntivo.

2. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que comprende un gen asociado a la diferenciación del melanoma (mda-7) en un vector y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el vector es un vector de adenovirus, vector de virus adenoasociado, vector del virus de Epstein-Barr, vector del virus del herpes, vector del VIH atenuado, vector de retrovirus o vector del virus vaccinia.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en la que el vector de adenovirus es un vector de adenovirus defectuoso en la replicación que expresa mda-7.

4. Uso de un ácido nucleico que comprende un gen asociado a la diferenciación del melanoma (mda-7) para la preparación de una composición farmacéutica para suprimir el crecimiento de una célula cancerosa en un sujeto, en el que la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en una célula de cáncer de mama, un cáncer de cuello del útero, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer nasofaríngeo, una célula de cáncer de pulmón, una célula de osteosarcoma y una célula de cáncer de tejido conjuntivo.

5. Uso de un ácido nucleico que comprende un gen asociado a la diferenciación del melanoma (mda-7) para la preparación de una composición farmacéutica para inducir apoptosis de una célula cancerosa en un sujeto, en el que la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en una célula de cáncer de mama, una célula de melanoma y una célula de glioblastoma multiforme.

6. Uso de un ácido nucleico que comprende un gen asociado a la diferenciación del melanoma (mda-7) para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto, en el que el tumor comprende células seleccionadas del grupo que consiste en células de cáncer de mama, células de cáncer de cuello del útero, células de cáncer de colon, células de cáncer de próstata, células de cáncer nasofaríngeo, células de cáncer de pulmón, células de osteosarcoma y células de cáncer de tejido conjuntivo.

7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 6, en el que el gen asociado a la diferenciación del melanoma (mda-7) está ligado a un elemento regulador de forma que su expresión está bajo el control del elemento regulador.

8. El uso según la reivindicación 7, en el que el elemento regulador es inducible o constitutivo o en el que el elemento regulador es un elemento regulador específico de tejido.

9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 8, en el que el ácido nucleico se introduce en las células por tecnología de ADN desnudo, vector de adenovirus, vector de virus adenoasociado, vector del virus de Epstein-Barr, vector del virus del herpes, vector del VIH atenuado, vectores retrovíricos, vector del virus vaccinia, liposomas, liposomas recubiertos de anticuerpos, medios mecánicos o eléctricos.

10. El uso de una cualquiera de la reivindicación 1 o 4 a 9, en el que la célula cancerosa se caracteriza por la presencia dentro de ella de un gen supresor de tumores defectuoso o por la presencia dentro de ella de un oncogén de acción dominante.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que el gen supresor del tumor es un gen p53, de retinoblastoma (RB) o p16ink4a o en el que el oncogén de acción dominante es el gen Ha-ras, p53 mutante o del virus del papiloma humano.