PIROFOSFATOS DE INOSITOL DETERMINANTES DE LA CAPACIDAD EXOCITÓTICA.

Quinasa IP6K1 o fragmentos activos de ésta, o bien un constructo de ácido nucleico capaz de expresar la quinasa IP6K1 o fragmentos activos de ésta para el uso en el tratamiento de la diabetes de tipo II.

Pirofosfatos de inositol determinantes de la capacidad exocitótica Antecedentes de la invención Los fosfoinosítidos, tanto en su forma soluble en agua como lipídica, desempeñan un papel destacado en los procesos de transducción de señales celulares. Los procesos importantes son la generación de inositol 1,4,5-trifosfato (Ins[1,4,5]P3) y su regulación de la homeóstasis intracelular del Ca2+ (1) y los productos lipídicos de inositol 3fosforilado de fosfatidilinositol (PI3 quinasa) (2), con diversas funciones en la mitogénesis, la apoptosis y el tráfico vesicular. El fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PtdIns [4,5]P2), la principal fuente de estos dos sistemas de señalización, no es sólo un precursor de las vías de transducción de señal que se menciona anteriormente, sino que desempeña por sí mismo papeles importantes en el tráfico vesicular, la exocitosis, las reordenaciones del citoesqueleto y la regulación de los canales iónicos (3). En la última década también se ha producido un creciente reconocimiento en el sentido de que los polifosfatos de inositol altamente fosforilados, derivados lejanos del segundo mensajero Ins(1,4,5)P3, desempeñan un papel en la transducción de señales y en la regulación celular (4-6). Quizá la perspectiva nueva más fascinante de las que se han abierto es la relacionada con el papel de los derivados diestéricos de los inositol pentaquisfosfatos e inositol hexaquisfosfatos (InsP5 e InsP6). Habitualmente, los derivados de pirofosfato del InsP6 difosfoinositol pentaquisfosfato y del bis-(difosfo)inositol tetraquisfosfato se denominan «InsP7» e «InsP8». Estos derivados de inositol pirofosfato se regeneran rápidamente, y se calcula que tienen una energía libre de hidrólisis similar a la del ATP (4). Una consecuencia llamativa de este grupo fosfato altamente energético es la capacidad del InsP7 de fosforilar directamente un subconjunto de proteínas de una forma independiente respecto del ATP y de las enzimas (7). La variedad de respuestas celulares, aparentemente controladas por estas moléculas (4,8), puede verse facilitada por la distribución intracelular diferencial de las quinasas que las componen (9). Las concentraciones de pirofosfatos de inositol pueden regularse dinámicamente durante fenómenos celulares fundamentales, subrayando así su importancia para la función celular. Por ejemplo, los niveles de InsP7 cambian durante la progresión del ciclo celular (10), y el InsP7 regula los complejos de ciclina/CDK (11), mientras que el InsP8 aumenta sobremanera como reacción al estrés celular (8). No obstante, los trabajos recientes también han puesto de manifiesto una función del InsP6 en forma de cofactor enzimático y, por analogía, es posible que, incluso en condiciones no estimuladoras, el InsP7 pudiera ser una molécula reguladora importante. Los fosfoinosítidos también son reguladores básicos de las células ß pancreáticas secretoras de insulina (12). Estas células son protagonistas fundamentales en la homeóstasis de la glucosa en sangre, y actúan acoplando los aumentos en la concentración de glucosa y otros reguladores circulatorios o de origen neuronal a la exocitosis de la insulina. El InsP6 altamente fosforilado es especialmente interesante, puesto que se ha demostrado que activa canales de Ca2+ de tipo L dependientes de voltaje (13), la exocitosis (14,15) y la endocitosis mediada por la dinamina (16), procesos todos ellos fundamentales en la secreción de la insulina. Aún no se ha determinado una función del InsP7 en la célula ß. No obstante, como consecuencia de la implicación sugerida de los pirofosfatos de inositol en el tráfico vesicular (4), la naturaleza fundamental de dichos fenómenos de tráfico para el proceso de exocitosis de la insulina y la alta concentración en las células ß del InsP6 (13), el precursor inmediato del InsP7, planteamos como hipótesis que los pirofosfatos de inositol pueden desempeñar un importante papel en la célula ß. Ahora, procedemos a demostrar una nueva función del InsP7 en la regulación de la exocitosis de la insulina. Breve descripción de la invención En un aspecto, la presente invención puede utilizarse para tratar la diabetes de tipo II mediante la administración a un paciente con diabetes de tipo II de una cantidad eficaz de la quinasa IP6K1 o un fragmento activo de ésta, o bien un constructo de ácido nucleico capaz de expresar la quinasa IP6K1 o fragmentos de ésta. En otro aspecto, la presente invención puede utilizarse estimulando la exocitosis de la insulina a partir de las células beta pancreáticas mediante la administración de una cantidad eficaz de la quinasa IP6K1 o de un fragmento activo de ésta, o bien de un constructo de ácido nucleico capaz de expresar la quinasa IP6K1 o fragmentos de ésta capaces de aumentar la expresión de la quinasa IP6K1, a un paciente que lo necesite. En otro aspecto, la presente invención puede utilizarse para tratar la diabetes de tipo II mediante la administración a un paciente con diabetes de tipo II de una cantidad eficaz de la quinasa IP6K1 o un fragmento activo de ésta, o bien un constructo de ácido nucleico capaz de expresar la quinasa IP6K1 o fragmentos de ésta, capaces de aumentar la producción de InsP7. En otro aspecto adicional, la presente invención ofrece métodos para identificar un compuesto para tratar la diabetes de tipo II, que comprenden: (a) poner en contacto células beta pancreáticas con uno o más compuestos de prueba; y (b) determinar el nivel de expresión de la quinasa IP6K1 y/o los niveles de InsP7; donde un incremento en el InsP7 indica que el compuesto es adecuado para tratar la diabetes de tipo II. 2   Breve descripción de los dibujos Figura 1. En las células ß pancreáticas hay altos niveles de InsP7, y las IP6K aparecen expresadas en estas células. (A) Comparación de InsP7 marcado con [3H] como porcentaje de InsP6 marcado con [3H] en islotes pancreáticos primarios o en células MIN6m9 secretoras de insulina. Los datos son de 3 experimentos independientes. (B) Los datos del islote de (A) se transformaron para tener en cuenta la diferente composición de células ß en islotes normales (60%) frente a islotes ob/ob (90 %). (C). La totalidad del ARN se extrajo de islotes y células MIN6m9, y se transcribió de forma inversa. La expresión relativa del ARN mensajero se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando sondas y cebadores adecuados. Los cebadores y las sondas para el ARNr 18S (reactivos de control del ARN ribosómico de TaqMan, Applied Biosystems) se utilizaron como control endógeno. Figura 2. La expresión de las IP6K fomenta la exocitosis en las células ß pancreáticas. La IP6K1 estimula la exocitosis dependiente del Ca2+. (A) Las células ß individuales de ratón fueron transfectadas con EGFP (simulación) o con una combinación de EGFP y bien una variante de tipo salvaje (IP6K1) o bien una variante de quinasa desactivada (IP6K1- K/A) de la IP6K, y sometidas a una serie de cuatro despolarizaciones de 500 ms utilizando la configuración de parche perforado. Los aumentos en la capacidad celular (Cm) se midieron con 3 mM de glucosa en el medio extracelular. (B) Histograma que resume el aumento medio en la capacidad celular trazado con respecto a las despolarizaciones individuales, así como el incremento total en la capacidad celular al final de la serie en células transfectadas de manera simulada o que sobreexpresan la IP6K de tipo salvaje (IP6K1) o de quinasa desactivada (IP6K1-K/A). (C) Histograma que muestra una corriente integrada de Ca2+ (QCa) trazada con respecto a las despolarizaciones individuales en células transfectadas de manera simulada o que sobreexpresan el tipo salvaje o el tipo IP6K1-K/A. Los valores proceden de 8-12 experimentos. °P<0,05. (D) Histograma que resume el aumento medio total en la capacidad celular al final de la serie en células transfectadas de manera simulada o en células que sobreexpresan el tipo salvaje (IP6Kn) o el tipo de quinasa desactivada (IP6Kn-K/A) de las quinasas de tipo 1, 2 y 3 respectivamente. Los valores proceden de 7- 12 experimentos. °P<0,05. (E) Las células INS-1E fueron cotransfectadas en paralelo con pCMV5-hGH y un vector vacío (pcDNA3) (simulación) o con pCMV5-hGH y bien con el tipo salvaje (IP6Kn) o bien con la quinasa desactivada (IP6Kn-K/A) de las quinasas de tipos 1, 2 y 3 respectivamente. La secreción de hGH se midió en medio de Krebs-Ringer amortiguado con bicarbonato-BEPES, que contenía 3 mM de glucosa. La liberación de hGH se representa como hGH secretada en porcentaje de hGH total. Valores procedentes de 3 experimentos (cada uno por triplicado). °P<0.05. Figura 3. El InsP7 fomenta, de forma dependiente de la dosis, la exocitosis dependiente del Ca2+. Las células p individuales de ratón fueron sometidas a una serie de cuatro despolarizaciones de 500 ms utilizando la configuración de parche... [Seguir leyendo]

1. Quinasa IP6K1 o fragmentos activos de ésta, o bien un constructo de ácido nucleico capaz de expresar la quinasa IP6K1 o fragmentos activos de ésta para el uso en el tratamiento de la diabetes de tipo II.

2. Quinasa IP6K1 o fragmentos activos de ésta, o bien un constructo de ácido nucleico capaz de expresar la quinasa IP6K1 o fragmentos activos de ésta para el uso según la reivindicación 1, donde la IP6K1 da lugar a un incremento de la expresión de InsP7.

3. Quinasa IP6K1 o fragmentos activos de ésta, o bien un constructo de ácido nucleico capaz de expresar la quinasa IP6K1 o fragmentos activos de ésta para el uso según la reivindicación 1, donde la IP6K1 estimula la exocitosis de la insulina a partir de células beta pancreáticas.

4. Quinasa IP6K1 o fragmentos activos de ésta, o bien un constructo de ácido nucleico capaz de expresar la quinasa IP6K1 o fragmentos activos de ésta para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la quinasa IP6K1 se administra mediante terapia génica.

5. Quinasa IP6K1 o fragmentos activos de ésta para su uso según la reivindicación 1 ó 3, donde la quinasa IP6K1 se conjuga con un dominio de transducción.

6. Un método para identificar un compuesto para tratar la diabetes de tipo II, que comprende:

(a) poner en contacto células beta pancreáticas con uno o más compuestos de prueba; y

(b) determinar los niveles de InsP7 en las células beta pancreáticas;

donde un incremento en el InsP7 indica que el compuesto de prueba es adecuado para tratar la diabetes de tipo II.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la puesta en contacto se lleva a cabo en presencia de entre 1 y 6 mM de glucosa.

8. El método de la reivindicación 6 ó 7, donde las células beta pancreáticas constan de islotes pancreáticos.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que las células beta pancreáticas comprenden islotes pancreáticos de Langerhans aislados, células beta de los islotes pancreáticos aislados o líneas celulares secretoras de insulina.