Procedimientos para el cribado de fármacos utilizando formación de imágenes in vivo no invasivas.

Procedimiento para el desarrollo de fármacos, que comprende:

(a) injertar células diana dentro de la cámara anterior ocular de un animal de prueba,

seleccionado de entre elgrupo constituido por ratón, mono, perro, gato y cerdo, en el que uno o más componentes celulares de interésterapéutico en las células diana trasplantadas son marcados de manera fluorescente;

(b) poner en contacto las células diana con uno o más compuestos de prueba; y

(c) llevar a cabo la formación de imágenes fluorescentes no invasiva en el ojo del animal de prueba, en el que laformación de imágenes fluorescentes es utilizada para detectar cambios inducidos en el compuesto deprueba en una o varias actividades, localización, y cantidad de componentes celulares marcadosfluorescentemente de interés terapéutico en las células diana injertadas, identificando los cambios aquelloscompuestos de prueba que pueden proporcionar un beneficio terapéutico a las células diana.

Procedimientos para el cribado de fármacos utilizando formación de imágenes in vivo no invasivas.

Antecedentes de la invención El conocimiento fundamental de los procesos celulares en la salud y la enfermedad se ha obtenido estudiando las células de varios tejidos in vitro. Sin embargo, los resultados obtenidos a partir de los experimentos in vitro no son suficientes, a menudo, para explicar el funcionamiento de las células en más configuraciones fisiológicas como los órganos enteros o los organismos vivientes. Para situar las observaciones llevadas a cabo en un sistema in vitro, en un contacto fisiológico los estudios tienen que llevarse a cabo bajo condiciones in vivo. Recientemente, se han realizado un número creciente de aproximaciones para investigar la función celular in situ, empleando técnicas de imagen. Desafortunadamente, a las técnicas no invasivas de imagen, como la tomografía computacional (CT) , la imagen mediante resonancia magnética (MRI) , la tomografía de emisión de positrones (PET) o la imagen bioluminiscente (BLI) , les falta resolución celular. Por otra parte, la microscopía confocal y la de cribado láser bifotónico mediante láser (LSM) , proporcionan una resolución subcelular pero muestran una distancia de actuación y una profundidad de imagen bastante limitada. El acceso de las células diana para la aplicación de LSM es más invasivo y a menudo excluye la posibilidad de exámenes repetidos.

ARBUZOVA M.I. et al.; PROBLEMY ENDOKRINOLOGII 1991 JAN-FEB, vol. 37, no 1. Enero 1991, p. 42-44 da a conocer el trasplante del páncreas embriónico a la cámara anterior del ojo.

BRAGIN A.G. et al., SU 1.369.039 A (AS BIOL PHYSICS INS) 7 septiembre 1988, da a conocer la compensación de la diabetes mellitus trasplantando la parte de la cola del páncreas embriónico al ojo de una rata de ensayo.

KULIKOV A V et al., MEMBRANE CELL BIOLOGY, vol. 11, no 6, 1998, páginas 737-742, da a conocer el trasplante de varios tejidos biológicos a la cámara anterior del ojo.

TRUBETSKAIA O.E. et al., IZVESTIIA AKADEMII NAUK. SERIIA BIOLOGICHESKAIA/ROSSI SKAIA AKADEMIIA NAUK 1994 JAN-FEB. no 1 Enero 1994, páginas 152-155, da a conocer el trasplante del páncreas embriónico a la cámara anterior ocular.

La patente US no 5.650.435 describe procedimientos y composiciones para detectar y localizar la luz que se origina a partir de un mamífero. Se describen los modelos animales para los estados patológicos y los procedimientos para el cribado de compuestos terapéuticos putativos efectivos para inhibir la enfermedad o el patógeno.

DE 197 03 734 A1 da a conocer un aparato utilizado para el examen no invasivo de células en un ojo viviente, las cuales células pueden trasplantarse.

Sumario de la invención La presente invención proporciona procedimientos para el desarrollo de fármacos, que comprenden;

(a) injertar células diana en el ojo de un animal de prueba, en el que uno o varios componentes celulares de interés terapéutico en las células diana trasplantadas, están marcadas de forma fluorescente;

(b) poner en contacto las células diana con uno o más compuestos de prueba; y

(c) llevar a cabo la formación de imágenes, fluorescente y no invasiva en el ojo del animal de prueba,

en el que la imagen fluorescente se utiliza para detectar cambios inducidos en el compuesto de prueba, en una o más actividades, localizaciones y cantidades de los componentes celulares marcados de forma fluorescente, de interés terapéutico en las células diana injertadas, donde los cambios identifican a los compuestos de prueba que pueden proporcionar un beneficio terapéutico a las células diana.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Islotes pancreáticos trasplantados a la cámara anterior ocular.

(a) Trasplantar islotes a la cámara anterior ocular. (b) Establecer la formación de imágenes no invasivas in vivo.

(c) Fotografía digital de los islotes injertados en el iris en la cámara ocular anterior (d-g) . Cortes oculares que contienen injertos de islotes que muestran células º inmunorreactivas a la insulina (en rojo) y células º glucagoinmunorreactivas (en verde) en puntos temporales distintos después del trasplante.

(h) Proporción de insulina a las células inmunorreactivas al glucagón en los islotes pancreáticos y en la cámara anterior ocular, en los tiempos indicados después del trasplante. (i) Niveles plasmáticos de glucosa durante

un ensayo intraperitoneal de tolerancia a la glucosa en ratones tratados con estreptozotocina trasplantados con islotes en los ojos (n = 8, negro) y por debajo de la cápsula renal (n = 2, rojo) .

Figura 2: Imagen no invasiva del injerto de los islotes y vascularización.

Imágenes de un injerto individual de islotes RIP-GFP 4 meses después del trasplante de un corte óptico capturado a una profundidad de 51 !m. (a) Fluorescencia de células GFP (verde) , (b) fluorescencia Rojo Texas, inyectada intravenosamente (rojo) y (c-d) proyección 2D de un montón de imágenes correspondientes a un grosor de 100 !m. Proyecciones (e-p) de las imágenes (grosor de 110 !m) de un injerto individual de los islotes RIP-GFP en los días 3, 7, 14 y 28 después del trasplante. La fluorescencia GFP de las células (e, h, k, n) y la fluorescencia Rojo Texas en los vasos sanguíneos (f, i, l, o) se muestran separadamente y como una capa (g, j, m, p) . Barras escalares, 100 !m. (q-r) Cuantificación de los resultados mostrados en (e-p) . El número de injertos de los islotes analizados se indica entre paréntesis en los tiempos respectivos.

Figura 3: Imágenes in vivo de la función de las células (a-e) . Imágenes de la fluorescencia de Fluo-4 y Fura-Red en los tiempos indicados después de la aplicación sistémica de glibenclamida (1 mg/kg) a los 3 minutos. (f) Cambio proporcional del marco total Fluo 4/Fura-Red en respuesta a un estímulo dado de glibenclamida, indicándose el principio de la estimulación por la flecha (g) . Cambio proporcional en las células individuales a través del islote, tal como se indica en el cuadro (a) . (h-i) proyecciones máximas de las fluorescencias Fluo-4 (verde) y Fura-Red (rojo) de un islote entero, antes (h) y después de la estimulación con glibenclamida (I) . (j-k) Exhibición proporciométrica de Fluo-4/Fura-Red del islote en el cuadro (h) e (i) . Barras escalares, 50 !m.

Figura 4: Imágenes no invasivas in vivo de la muerte de las células . (a-h) Proyecciones de las imágenes de un islote individual RIP-GFP en la cámara anterior ocular. Bajo condiciones normales, (a) fluorescencia de células GFP, (b) reflejo de las células endocrinas y (c) Marcado de la anexina V-APC indetectable del injerto. (d) Imagen en capa de (a-c) con la imagen de reflejo en azul. Veinticuatro horas después de la inducción de la muerte de las células , (e) Fluorescencia de las células (f) , reflejo y (G) fluorescencia intensa de la anexina V-APC del injerto de los islotes. (h) Imagen en capa de (e-g) con la imagen del reflejo en azul. (i-j) Imágenes de alta amplificación de un área de injerto de los islotes marcada intensamente con la anexina V-APC después de la inducción de la muerte de las células (i) fluorescencia de las células GFP, (j) fluorescencia de la anexina V-APC y (k) capa de (i-j) , (I) capa de (k) con la imagen de reflejo (azul) . Barras de escalares, 100 !m.

Figura 5: Imagen no invasiva del injerto de los islotes y vascularización. Se muestran proyecciones (a-f) de la imagen (110 !m de grosor) del mismo injerto de los islotes RIP-GFP, tal como se exponen en la figura 2, se muestran a los 2 y 4 meses después del trasplante. La fluorescencia GFP de las células (a, d) y la fluorescencia Rojo Texas en los vasos sanguíneos (b, e) se muestran separadamente y como una capa (c, f) . Barras escalares de, 100 !m.

Descripción detallada de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para el desarrollo de fármacos, que comprenden:

(a) injertar células diana en el ojo de un animal de prueba, donde uno o varios compuestos celulares de interés terapéutico en las células diana trasplantadas, están marcadas fluorescentemente;

(b) poner en contacto de las células diana con uno o más compuestos de prueba, y

(c) llevar a cabo la formación de imágenes fluorescentes no invasiva en el ojo del animal de prueba,

en el que la imagen fluorescente se utiliza para detectar cambios inducidos en el compuesto de prueba en una o varias actividades, localización y cantidad de los componentes celulares marcados fluorescentemente de interés terapéutico en las células diana injertadas, donde los cambios identifican aquellos compuestos de prueba que pueden... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el desarrollo de fármacos, que comprende:

(a) injertar células diana dentro de la cámara anterior ocular de un animal de prueba, seleccionado de entre el grupo constituido por ratón, mono, perro, gato y cerdo, en el que uno o más componentes celulares de interés terapéutico en las células diana trasplantadas son marcados de manera fluorescente;

(b) poner en contacto las células diana con uno o más compuestos de prueba; y 10

(c) llevar a cabo la formación de imágenes fluorescentes no invasiva en el ojo del animal de prueba, en el que la formación de imágenes fluorescentes es utilizada para detectar cambios inducidos en el compuesto de prueba en una o varias actividades, localización, y cantidad de componentes celulares marcados fluorescentemente de interés terapéutico en las células diana injertadas, identificando los cambios aquellos compuestos de prueba que pueden proporcionar un beneficio terapéutico a las células diana.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células diana son derivadas de un tejido seleccionado de entre el grupo constituido por células endocrinas, grasas, músculos, cerebro, hígado, corazón, riñón y pulmones.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que uno o más compuestos de prueba son aplicados por vía tópica en el ojo del animal de prueba.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que uno o más de los compuestos de prueba son inyectados dentro de la cámara anterior ocular del animal de prueba. 25

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la formación de imágenes fluorescentes comprende microscopía de cribado por láser.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la formación de imágenes fluorescentes

es utilizada para detectar los cambios inducidos por el compuesto de prueba en uno o varios de entre la actividad, la localización y la cantidad de los componentes celulares marcados de forma fluorescente de interés terapéutico en las células diana injertadas en múltiples puntos temporales distintos.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células diana comprenden células 35 beta pancreáticas.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células diana son células individuales.