ApoCIII y tratamiento y diagnóstico de la diabetes.

Procedimiento para identificar compuestos candidatos para el tratamiento de la diabetes tipo I in vitro,

quecomprende el contacto de células ß pancreáticas con una cantidad de apolipoproteína CIII ("apoCIII") efectiva paraaumentar la concentración de calcio intracelular en presencia de uno o más compuestos de prueba, e identificaraquellos compuestos de prueba que inhiben un aumento inducido por apoCIII en la concentración de calciointracelular en las células pancreáticas.

ApoCIII y tratamiento y diagnóstico de la diabetes.

Antecedentes de la invención Los canales de Ca2+ de tipo-L que constituyen compuertas del voltaje tienen un importante papel fisiológico en la transducción de señales de las células º pancreáticas (“células º”) (1) . Estos canales constituyen un enlace esencial entre cambios transitorios en el potencial de membrana y la liberación de insulina a partir de las células º. Los cambios en la concentración de Ca2+ libre citoplásmico ([Ca2+]) en las células º se asocian con la activación de un espectro de señales intracelulares y están estrictamente regulados, pues el alto [Ca2+]i es perjudicial para las células.

Juntti-Berggrem L. et al. SCIENCE, vol. 261, nº 5117, 2 de Julio de 1993, páginas 86-90 da a conocer que los bloqueantes de los canales de calcio de tipo-L activados por el voltaje pueden evitar la destrucción de las células º pancreáticas.

Rabinovitch A. et al. ENDOCRINOLOGY, vol. 142, nº 8, Agosto del 2001, páginas 3.649-3655, da a conocer que la expresión de Calbindina-D28k en una progenie de células º de un isolote pancreático, protege contra la apoptosis inducida por citoquinas.

Tada N. et al. THE TOHOKU JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 141 Suppl, Diciembre de 1983, páginas 619-626, da a conocer que el grado de sialización de las apolipoproteínas en los diabéticos puede variar. Este documento no evalúa la sialización de las apolipoproteínas en individuos sanos.

Callow M.J. and Redgrave T.G. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1.168, nº 3, 1 de Julio, 1993, páginas 271-279, da a conocer un estudio sobre la distribución de isoformas de las apolipoproteínas E y CIII en ratas diabéticas, comparadas con ratas de control.

Davignon J. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY, vol. 14, nº SUPPL B, Mayo de 1998, páginas 28B-38D, se refiere al tratamiento de la dislipidemia, pero no al de la diabetes tipo I.

Reverter J.L. et al. CLINICA CHIMICA ACTA, vol. 223, nº 1-2, 1993, páginas 113-120, da a conocer un estudio sobre los efectos de la terapia insulínica a pacientes de diabetes tipo I recientemente diagnosticados.

Alsayed N. et al. CLINICAL CHEMISTRY, vol. 34, nº 1, enero de 1988, páginas 49-52, se refiere a un procedimiento de purificación para anticuerpos anti-CIII apolipoproteínas.

Pérez A. et al. ARCHIVES OF INTERNAL MEDICINE, vol. 160, nº 18, 9 de octubre, 2000, páginas 2.756-2762, da a conocer que la dislipidemia es una enfermedad que puede asociarse con los diabéticos de tipo I y con pacientes que no padecen diabetes.

En este tipo I de diabetes (T1D) , existe una destrucción específica de las células º pancreáticas que secretan insulina. Los sueros de pacientes diabéticos de tipo I (T1D) diagnosticados recientemente, han mostrado un aumento de la actividad de los canales de Ca2+ de tipo-L que constituyen compuertas del voltaje en las células º que da lugar a un aumento de [Ca2+]i después de la despolarización y apoptosis de las células º, efectos que pueden evitarse mediante bloqueadores de canales de Ca2+ (2) . Sin embargo, no se ha determinado qué factor en el suero de los T1D es responsable de los cambios en el [Ca2+]i.

Se demuestra a continuación que la apolipoproteina CIII (apoCIII) aumenta en el suero de los pacientes T1D y que este factor sérico induce tanto un aumento de la concentración del Ca+2 citoplásmico libre ([Ca2+]i) como de la muerte de las células º.

Sumario de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para identificar compuestos candidatos para el tratamiento de la diabetes tipo I in vitro que incluye poner en contacto las células º pancreáticas con una cantidad de apolipoproteina CIII (“apoCIII”) efectiva para aumentar la concentración del calcio intracelular en presencia de uno o más compuestos de prueba, identificando aquellos que inhiben un aumento inducido por apoCIII en la concentración de calcio intracelular en las células pancreáticas º. En otro aspecto, la presente invención proporciona la utilización de un inhibidor de apoCIII seleccionado a partir del grupo formado por un anticuerpo selectivo de apoCIII, un oligonucleótido antisentido dirigido contra el ARN de apoCIII, y un ARN pequeño de interferencia dirigido contra el ARNm de apoCIII, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar la diabetes de tipo I, en la que la composición farmacéutica es para administrar a un paciente con la diabetes de tipo I una cantidad efectiva del inhibidor de apoCIII para reducir el aumento inducido por apoCIII en la concentración de calcio intracelular en las células pancreáticas º. En otro aspecto todavía, la presente invención proporciona utilizaciones de un inhibidor de apoCIII seleccionado a partir del grupo formado por un anticuerpo selectivo para apoCIII, un oligonucleótido antisentido dirigido contra el ARNm de apoCIII, y un ARN pequeño de interferencia dirigido contra el ARNm de apoCIII, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar la diabetes de tipo I.

En otro aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para el diagnóstico de una propensión a desarrollar diabetes de tipo I, que comprende la determinación de una cantidad de apoCIII sialilizado en una muestra sérica sanguínea de un individuo, y el diagnóstico de los individuos que presentan una cantidad elevada de apoCIII sialilizado en la muestra sérica sanguínea con respecto al control, como mostrando una propensión a desarrollar la diabetes de tipo I.

En otro aspecto, aún, la presente invención proporciona procedimientos para identificar pacientes diabéticos para ser tratados con terapia anti-apoCIII, que comprenden la determinación de una cantidad de apoCIII en una muestra de suero sanguíneo de un individuo diabético y compararla con una muestra control de suero sanguíneo; e identificar aquellos individuos con una cantidad elevada de apoCIII en la muestra de suero sanguíneo, respecto a la muestra control de suero sanguíneo, como siendo individuos a los que se les debe tratar con terapia anti-apoCIII, en la que los individuos que van a ser tratados con terapia anti-apoCIII, deben tratarse con un compuesto terapéutico apoCIII seleccionado del grupo formado por un anticuerpo apoCIII selectivo, un oligonucleótido antisentido dirigido contra el ARNm de apoCIII, y un ARN pequeño dirigido contra el ARNm de apoCIII.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Cambios en [Ca2+]i en las células pancreáticas de ratones expuestos a sueros T1D o de control. En cinco de los siete sueros T1D se indujo un aumento potenciado en [Ca2+]i, cuando las células se despolarizaron con altas concentraciones de K+ para abrir el canal de Ca+2 compuerta del voltaje, comparado con las células que se expusieron a suero normal (n = 29, 28, 32, 47, 21, 27, 31 y 18, respectivamente) , ***P<0, 001, **P<0, 01 y *P<0, 05 con respecto al control.

Figura 2. Separación gradual paso e identificación de la fracción activa en el suero T1D A, Después de la primera separación mediante RP-HPLC, se descubrió que en la fracción marcada 3, se daba un aumento más alto en [Ca2+]i B, La fracción 3 (Fig. 2A) se reprocesó secundariamente mediante RP-HPLC bajo condiciones idénticas. Las fracciones se ensayaron otra vez con respecto a la actividad estimulante de [Ca2+]i (Fig. 2C) , identificándose una fracción positiva (nº 2) . D, la fracción activa (Fig. 2B) se volvió a someter a cromatografía. La fracción, que indujo un aumento más alto en [Ca2+]i cuando las células se despolarizaron con concentraciones altas de K+, se señala con una línea. C, Las células pancreáticas incubadas con cuatro fracciones procedentes de RP-HPLC de sueros diabéticos a partir de la Fig. 2B (n = 6, 11, 12, 11 y 10 respectivamente) , *** P<0, 001 con respecto al control. E, la fracción activa de la Fig. 2C se analizó mediante espectrometría de masas por electropulverización.

Figura 3. Cantidades de apoCIII en sueño T1D y efectos en [Ca2+]i y muerte celular, A, niveles relativos de apoCIII1+2 en suero T1D y de control, dados como área bajo la curva (AUC) , **P<0, 01 (n=5) . B, células pancreáticas se incubaron con apoCIII o apoCIII + anticuerpos contra apoCIII humano (n=63, 35 y 33) , ***P<0, 001 respecto al control C, las células se incubaron con un control o un suero T1D y un suero T1D + anti-apoCIII (n= 18, 17 y 20) , ***P<0, 001 con respecto al suero T1D. D, Las células de ratón se incubaron con apoCIII0, apoCIII1, apoCIII2 o el vehículo (control) (n=54, 40, 48, 37) , ***P<0, 001 con respecto al control. E, la progenie celular secretora de insulina RINm5F se expuso a los sueros de control y del T1D, y al suero T1D... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para identificar compuestos candidatos para el tratamiento de la diabetes tipo I in vitro, que comprende el contacto de células pancreáticas con una cantidad de apolipoproteína CIII (“apoCIII”) efectiva para aumentar la concentración de calcio intracelular en presencia de uno o más compuestos de prueba, e identificar aquellos compuestos de prueba que inhiben un aumento inducido por apoCIII en la concentración de calcio intracelular en las células pancreáticas.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la apoCIII comprende apoCIII sialilizada. 10

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la apoCIII está purificada sustancialmente.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la síntesis de los compuestos de prueba que

inhiben un aumento inducido por apoCIII en la concentración de calcio intracelular en las células pancreáticas. 15

5. Utilización de un inhibidor de apoCIII, seleccionado de entre el grupo que consiste en un anticuerpo selectivo para apoCIII, un oligonucleótido antisentido dirigido contra el ARNm de apoCIII, y un pequeño ARN de interferencia dirigido contra el ARNm de apoCIII, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes tipo I.

6. Procedimiento para diagnosticar una propensión a desarrollar la diabetes tipo I en un individuo, que comprende:

(a) determinar una cantidad de apoCIII sialilizada en una muestra sérica sanguínea de un individuo;

(b) comparar la cantidad con una cantidad de apoCIII sialilizada en una muestra sérica sanguínea de control; y

(c) diagnosticar aquellos individuos con una cantidad elevada de apoCIII sialilizada en la muestra sérica sanguínea con respecto al control, como que presentan una propensión a desarrollar la diabetes tipo I.

7. Procedimiento para identificar los pacientes diabéticos que deben ser tratados con una terapia anti-apoCIII, que comprende:

(a) determinar una cantidad de apoCIII en una muestra sérica sanguínea de un sujeto diabético, y compararla con una muestra sérica sanguínea de control; y 35

(b) identificar aquellos individuos con una cantidad elevada de apoCIII en la muestra sérica sanguínea, con respecto a la muestra sérica sanguínea de control como individuos que deben ser tratados con una terapia antiapoCIII,

en el que los individuos que deben ser tratados con la terapia anti-apoCIII, van a ser tratados con un compuesto terapéutico apoCIII, seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo selectivo para apoCIII, un oligonucleótido antisentido dirigido contra el ARNm de apoCIII, y un pequeño ARN de interferencia, dirigido contra el ARNm de apoCIII.