Procedimiento de obtención de extractos de hojas de Corema album y su aplicación terapéutica.

La presente invención tiene por objeto a un extracto citotóxico procedente de las hojas de Corema album (Ericaceae),

así como a sus fracciones y principios activos aislados, que generan especies reactivas de oxígeno (ERO) e inducen apoptosis. También incluye las composiciones farmacológicas que contienen tanto al extracto como a fracciones o principios activos aislados de éste y al uso de estas composiciones en la preparación de medicamentos para la prevención y el tratamiento del cáncer. La presente invención tiene su aplicación en el sector farmacéutico.

Procedimiento de obtención de extractos de hojas de Corema álbum y su aplicación terapéutica

Objeto

La presente invención tiene por objeto un extracto de acetato de etilo procedente de las hojas de Corema álbum (L.) D. Don (Ericaceae), con actividad citotóxica, así como a los principios activos aislados del mismo, que generan especies reactivas de oxígeno e inducen apoptosis.

La presente invención pertenece al área científica Farmacéutica, dado que establece los métodos de obtención y análisis fitoquímico de extractos de las hojas de Corema álbum, así como fracciones y principios activos aislados y su actividad citotóxica. La industria farmacéutica de productos naturales y la industria agroalimentaria son potenciales usuarios de la presente invención, que podrá aplicarse para el desarrollo de medicamentos, nutracéuticos o alimentos funcionales en el tratamiento y prevención del cáncer.

Estado de la técnica

El cáncer supone un 12.5% de las muertes en el mundo al año. A pesar de los avances médicos, la tasa de mortalidad no ha sufrido apenas variación en las últimas décadas. La cirugía y la radioterapia han demostrado ser efectivas en las primeras etapas de la aparición del tumor, pero en muchos casos éste no es detectado hasta que ya ha producido metástasis en otros órganos. Entonces, es necesario administrar por vía sistémica agentes quimioterapéuticos que, al producir numerosos efectos adversos, han de administrarse a dosis que resultan ineficaces en muchos casos. Esta ineficacia se refleja en las bajas tasas de supervivencia en pacientes con un cáncer avanzado (Jemal et al., 2011. Glob. Canc.Stat., 61(2), 69- 90).

La baja eficacia de la terapia actual del cáncer en pacientes con metástasis, junto con los efectos adversos y la aparición de tumores resistentes, hace necesario el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos. El uso de productos naturales es

especialmente extenso en Oncología, donde, de las 155 moléculas de bajo peso molecular aprobadas entre la década de 1940 y 2006, un 73% estaban relacionadas con productos naturales (Cragg et al., 2009. Chem. Rev. 109(7), 3012-3043).

Existe un creciente interés por los extractos vegetales como una alternativa en el tratamiento y prevención de enfermedades neoplásicas ya que en muchos casos se puede disponer de materia prima en cantidad por un menor coste y pueden tener igual o mayor eficacia a los antineoplásicos existentes.

Las chalconas constituyen un importante grupo de compuestos fenólicos que presentan una gran variedad de actividades biológicas, como antioxidante, antiinflamatoria, antibacteriana, citotóxica... Están de manera natural en nuestra dieta y en distintas plantas medicinales, por ejemplo, isoliquiritigenina es abundante en el regaliz, obtenido de la raíz de Glycyrrhiza glabra. En los últimos años se ha puesto de manifiesto la capacidad de las chalconas y sus derivados para inhibir diferentes pasos del desarrollo de la carcinogénesis, y su implicación en los mecanismos de apoptosis de células transformadas y la regulación del ciclo celular, por lo que se presentan como una familia de moléculas con gran potencial en la quimioprevención y tratamiento del cáncer. Entre los mecanismos de acción de las chalconas se encuentra la interacción con los factores de transcripción NF-kB, STAT3, AP-1, NRF2, PPAR-y, que regulan la expresión de numerosos genes implicados en el proceso de la carcinogénesis y que forman parte de las rutas de señalización celular en estados de estrés oxidativo e inflamatorio. Además, se ha visto que las chalconas pueden prevenir la etapa de progresión tumoral mediante la activación de la apoptosis, tanto por la vía extrínseca como intrínseca, siendo la proteína antiapoptótica Bcl-2 una de las dianas más frecuentes (Yadav et al., 2011. Int Immunopharmacol, 11(3), 295-309).

Corema álbum, es una especie perteneciente a la familia Ericaceae, la cual también incluye especies de gran interés agroindustrial, como los arándanos (Vaccinium sp.). Crece en los arenales y dunas subcosteras del litoral atlántico de la Península Ibérica. En España aparece en las costas gallegas de La Coruña y Pontevedra y en Andalucía en diferentes puntos del litoral de Huelva y Cádiz. Es un arbusto dioico, de hasta 1m de altura, muy ramificado. Las ramas inferiores son glabras y con numerosas cicatrices foliares; las de los últimos años, densamente tomentosas, con pelos poco ondulados y color grisáceo. Las hojas son xeromórficas, adaptadas al clima seco y miden en tomo a 5-6 x 1-2 mm. No existen datos previos publicados

acerca de la composición química o actividad farmacológica de las hojas de esta especie.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a la obtención y uso de cualquier extracto, fracción 5 o principio activo aislado de las hojas de Corema álbum (L.) D. Don, Ericaceae, en la prevención y tratamiento de enfermedades neoplásicas; preferentemente el extracto de acetato de etilo que presenta marcada actividad citotóxica en la línea celular HT- 29 procedente de adenocarcinoma de colon frente al patrón utilizado 5-fiuouracilo (Cl50: 15.8 ± 2.6 y 16.2 ± 2.6 jxg/mL, respectivamente).

La actividad citotóxica mostrada por el extracto en la línea celular HT-29 procedente de adenocarcinoma de colon, se mantiene en las fracciones y los compuestos aislados, 2,4-dihidroxidihidrochalcona (CI5o: 1.8 ± 0.4 p.M), 2-metoxi-4- hidroxidihidrochalcona (Cl50: 8.5 ±2.1 jaM) y fracción de pinocembrina y 2,4- dihidrochalcona (Cl50: 6.8 ± 1.2 jig/mL) frente al patrón de 5-fluorouracilo (Cl50: 8.7 ± 15 4.0 |xM, 16.2 ± 2.6 jxg/mL). Por tanto, el extracto, fracciones o los compuestos

podrían ser empleados en la terapia antitumoral.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un extracto de las hojas de Corema álbum caracterizado porque se identifican ios principios activos 2,4-dihidroxidihidrochalcona, 2-metoxi-4-hidroxidihidrochalcona, 20 pinocembrina, 2,4-dihidrochalcona, ácido ursólico y ácido oleanólico que presentan actividad citotóxica y esta actividad es debida a que generan apoptosis y una parada en el ciclo celular en la fase G2/M.

Un segundo aspecto de la presente invención, se refiere a la obtención del extracto que se describe anteriormente, obtenido usando un procedimiento de extracción que 25 comprende los pasos:

a) Desecar las hojas de Corema álbum a temperatura ambiente

b) Añadir entre 1 y 10 volúmenes de acetato de etilo u otro disolvente orgánico (p.ej. acetona, hexano, etanol, metanol) o mezcla de solventes a las hojas desecadas

c) Extraer entre 30 y 120 minutos a temperatura ambiente en baño de ultrasonido. El proceso extractivo descrito puede repetirse si fuese necesario a fin de aumentar el rendimiento. También puede ser extraído por

maceración, percolación o extracción continua, d) Finalmente filtrar y concentrar a presión reducida en rotavapor para obtener un extracto seco.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al fraccionamiento y análisis de 5 dicho extracto, caracterizado por la cromatografía del extracto en columna de sílice utilizando como eluyente n-hexano y acetato de etilo en diferentes gradientes. Las fracciones obtenidas fueron agrupadas de acuerdo a su comportamiento cromatográfico (Ver Tabla 1).

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Tabla 1. Fraccionamiento cromatográfico del extracto de acetato de etilo de la hoja de Corema álbum. CA1: 2,4-dihidroxidihidrochalcona; CA2: 2-metoxi-4- hidroxidihidrochalcona; CA3: pinocembrina; CA4: 2,4-dihidrochalcona.

La composición de las fracciones de mayor contenido en compuestos fenólicos es 15 determinada empleando diferentes técnicas analíticas, incluyendo espectrometría de

masas y resonancia magnética nuclear.

Por último, el extracto de las hojas de Corema álbum, sus fracciones o principios activos aislados del mismo podrán administrarse en forma de preparado medicamentoso caracterizado por actividad citotóxica. La formulación de los 5 preparados medicamentosos podrá hacerse siguiendo cualquiera de los procedimientos convencionales, pudiendo presentarse en forma de polvo, papeles, granulado, cápsula, sello, pastilla, comprimido, tableta, solución, jarabe, suspensión, tintura o cualquier otra forma farmacéutica. Los preparados farmacéuticos que contengan extractos de hojas de Corema álbum podrán formularse con diferentes 10 vehículos, excipientes...

1. Procedimiento de obtención de un extracto de las hojas de Corema álbum (L.) D., caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) Desecar las hojas de Corema álbum a temperatura ambiente

b) Añadir entre 1 y 20 volúmenes de acetato de etilo u otro disolvente orgánico o mezcla de disolventes a las hojas desecadas.

c) Extraer entre 30 y 120 minutos a temperatura ambiente en baño de ultrasonido. El proceso extractivo descrito puede repetirse si fuese necesario a fin de aumentar el rendimiento.

d) Finalmente filtrar y concentrar a presión reducida en rotavapor para obtener un extracto seco.

2. Procedimiento de obtención de un extracto de las hojas de Corema álbum (L.) D., según reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa c) la extracción se hace por maceración o percolación o extracción continua.

3. Procedimiento de obtención de un extracto de las hojas de Corema álbum (L.) D., según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el extracto de Corema álbum puede ser fraccionado cromatográficamente, manteniendo las fracciones su actividad citotóxica porque contenga algunos de los principios activos

4. Extracto de hojas de Corema álbum (L.) D. obtenido por el procedimiento descrito en las reivindicaciones anteriores, caracterizado por contener los compuestos activos 2,4-dihidroxidihidrochalcona, pinocembrina, 2,4-dihidroxichalcona, 2- metoxi-4-hidroxidihidrochalcona.

5. Uso del extracto de hojas de Corema álbum (L.) D., según reivindicaciones anteriores, en la preparación de un medicamento con actividad citotóxica, preferentemente en la línea HT-29 de adenocarcinoma de colon humano.

6. Uso del extracto de hojas de Corema álbum (L.) D., según reivindicaciones anteriores, en la preparación de un medicamento para la quimioprevención y el tratamiento del cáncer.