Moléculas de unión a ILT3 y usos de las mismas.

Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo,

que comprende:

una región determinante de complementariedad 1 (CDR1 de VH) de la región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 3;

una región determinante de complementariedad 2 (CDR2 de VH) de la región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 4;

una región determinante de complementariedad 3 (CDR3 de VH) de la región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 5;

una región determinante de complementariedad 1 (CDR1 de VL) de la región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 6;

una región determinante de complementariedad 2 (CDR2 de VL) de la región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 7; y

una región determinante de complementariedad 3 (CDR3 de VL) de la región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 8;

en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a ILT3 humano.

Moléculas de unión a ILT3 y usos de las mismas Antecedentes de la invención

El transcrito tipo inmunoglobulina (ILT) 3 es una molécula de superficie celular que es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina. ILT3 se expresa de forma selectiva por células mieloides presentadoras de antígeno (APC) tales como monocitos, macrófagos, y células dendríticas (DC). La región citoplasmática de ILT3 contiene motivos inhibidores putativos basados en tirosina de inmuno-receptor (ITIM). El co-ligamiento de ILT3 a receptores estimuladores expresados por APC provoca un debilitamiento del flujo aumentado de [Ca2+] y la fosforilación de tirosina activada por estos receptores. La extinción de la señal implica a la proteína tirosina fosfatasa 1 que contiene SH2, que se recluta por ILT3 tras entrecruzamiento. ILT3 también puede funcionar en la captura y presentación de antígeno. Se internaliza de forma eficaz tras entrecruzamiento y suministra su ligando a un compartimiento intracelular donde se procesa y presenta a células T (Celia, et al. (1997) J. Exp. Med. 185:1743-1751).

Por tanto, ILT3 es un receptor inhibidor que puede regular de forma negativa la activación de APC y puede usarse por las APC para la captación de antígeno. El desarrollo de agentes útiles en la modulación de la señalización mediante ILT3 sería de gran beneficio para modular las respuestas inmunes.

Se ha demostrado que el efecto de células CD8 + CD28-TS sobre la proliferación de células CD4 + TH está mediado por el receptor inhibidor ILT3 en APC y puede revertirse in vitro por un anticuerpo anti-ILT-3 (Chang C. C. et al., Nat. Immunol 2002, 3: 237-243).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona moléculas de unión que se unen específicamente a ILT3, por ejemplo, ILT3 humano (hlLT3), en células, tales como células presentadoras de antígeno, por ejemplo, monocitos, macrófagos y células dendríticas, por ejemplo, células dendríticas derivadas de monocitos. Las moléculas de unión de la invención se caracterizan por la unión a hlLT3 con alta afinidad y modulación negativa de la activación de células inmunes in vitro, por ejemplo, modulación negativa de respuestas alo-inmunes; la producción de citoquinas inflamatorias por células dendríticas, por ejemplo, células dendríticas derivadas de monocitos (MDDC); la regulación positiva de moléculas co-estlmuladoras por DC, por ejemplo, MDDC; y/o el flujo de calcio en monocitos. Además, las moléculas de unión regulan positivamente la expresión de receptores Inhibidores sobre células dendríticas, por ejemplo, células dendríticas Inmaduras. Sorprendentemente, estas mismas moléculas de unión que modulan negativamente la activación de células inmunes in vitro, son inmunoestlmuladoras in vivo, por ejemplo, modulan positivamente las respuestas Inmunes.

Un aspecto de la invención destaca una molécula de unión que comprende las CDR mostradas en las SEC ID N° 3-8 donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a ILT3.

Un aspecto de la invención destaca una molécula de unión que comprende una región variable de cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-135 de la secuencia de la SEC ID N° 1 y que comprende adlclonalmente una reglón variable de cadena ligera que comprende los aminoácidos 21-127 de la secuencia de la SEC ID N° 2, donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a ILT3.

En otra realización más, la molécula de unión modula negativamente la producción de citoquinas Inflamatorias por células dendríticas in vitro, o modula negativamente la regulación positiva de moléculas co-estimuladoras en células dendríticas in vitro, o modula positivamente la expresión de receptores inhibidores en células dendríticas in vitro.

En una realización, la molécula de unión es un anticuerpo de ratón.

En otra realización, la molécula de unión es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

Otro aspecto de la Invención destaca una composición que comprende una molécula de unión de la Invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se describe la composición que comprende adlclonalmente al menos un agente terapéutico adicional que modula positivamente una respuesta Inmune en un sujeto.

Otro aspecto más de la Invención destaca un método para tratar el cáncer en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula con una molécula de unión de la invención, de modo que se trata el cáncer en un sujeto.

En una realización, el tipo de cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en: cáncer pancreático, melanomas,

cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer de bronquios, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de

páncreas, cáncer de estómago, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer cerebral o del sistema nervioso

central, cáncer del sistema nervioso periférico, cáncer de esófago, cáncer cervical, cáncer de útero o endometrial, cáncer de la cavidad oral o faringe, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer testicular, cáncer del tracto biliar, cáncer del intestino delgado o apéndice, cáncer de glándulas salivares, cáncer de glándula tiroides, cáncer de glándula suprarrenal, osteosarcoma, condrosarcoma, y cáncer de tejidos hematológlcos.

Un aspecto de la Invención destaca una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótldos que codifica una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N° 9, y una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N° 10.

Un aspecto de la Invención destaca una molécula aislada de ácido nucleico que comprende las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID N° 11-16, donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a ILT3 humano.

En una realización, se destaca un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de unión de la invención. En otra realización, la invención destaca una célula hospedadora en que se ha introducido el vector de expresión recombinante de la invención. En otro aspecto la invención destaca un método para producir una molécula de unión que se une a ILT3 humano, que comprende cultivar la célula hospedadora de la invención en un medio de cultivo hasta que se produzca una molécula de unión que se una a ILT3 humano por la célula.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que demuestra que las células dendríticas derivadas de monocitos (MDDC) diferenciadas en presencia de 9B11 muestran una expresión inferior de moléculas co-estlmuladoras de superficie celular, tales como CD86, CD80, CD83 y HLA-DR, medida por citometría de flujo.

La Figura 2 es un gráfico que demuestra que las MDDC son incapaces de generar una respuesta de células T alogénicas en una reacción mixta de linfocitos.

La Figura 3 es un gráfico que demuestra que las MDDC cultivadas en presencia de 9B11 son incapaces de producir IL-12, TNFa o IL-1a cuando se estimulan con LPS.

La Figura 4 es un gráfico que demuestra que células dendríticas sanguíneas recién aisladas incubadas con 9B11 eran incapaces de regular de forma completamente de forma positiva la expresión de moléculas coestimuladoras cuando se usa un cóctel de citoquinas (IL-6, IL-1j3, TNFa, y PGE) para madurar las células.

La Figura 5 muestra que la adición de 9B11 a monocitos, inducidos por activación de un motivo de activación basado en tirosina de inmuno-receptor (ITAM) en CD32, inhibe el flujo de Ca+2.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona moléculas de unión que se unen específicamente a ILT3, por ejemplo, ILT3 humano (hlLT3), en células presentadoras de antígeno, tales como por ejemplo, monocitos, macrófagos y células dendríticas (DC), por ejemplo, células dendríticas derivadas de monocitos (MDDC). Las moléculas de unión de la invención se caracterizan por la unión a hlLT3 con alta afinidad y modulación negativa de respuestas Inmunes in vitro, por ejemplo, modulación negativa de respuestas aloinmunes; la producción de citoquinas inflamatorias por células dendríticas, por ejemplo, células dendríticas derivadas de monocitos (MDDC); la regulación positiva de moléculas co-estimuladoras por DC, por ejemplo, MDDC; y/o el flujo de calcio en monocitos. Además, las moléculas de unión regulan positivamente la expresión de receptores inhibidores en células dendríticas, por ejemplo, células dendríticas inmaduras. Sorprendentemente, estas mismas moléculas... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:

una región determinante de complementariedad 1 (CDR1 de VH) de la región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N° 3;

una reglón determinante de complementariedad 2 (CDR2 de VH) de la reglón variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N° 4;

una reglón determinante de complementariedad 3 (CDR3 de VH) de la región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N° 5;

una reglón determinante de complementariedad 1 (CDR1 de VL) de la reglón variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N° 6;

una reglón determinante de complementariedad 2 (CDR2 de VL) de la reglón variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N° 7; y

una reglón determinante de complementariedad 3 (CDR3 de VL) de la región variable de cadena ligera (VL) que

comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N° 8;

en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a ILT3 humano.

2. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 que comprende una reglón variable de cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-135 de la SEC ID N° 1 y que comprende adlclonalmente una región variable de cadena ligera que comprende los aminoácidos 21-127 de la SEC ID N° 2, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a ILT3 humano.

3. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 que comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 26 y la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 25; o (¡i) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 27 y la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 25; en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a ILT3 humano.

4. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende adlclonalmente una región constante de cadena pesada.

5. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno:

(I) modula negativamente la producción de citoquinas inflamatorias por células dendríticas in vitro\ o

(¡I) modula negativamente la regulación positiva de moléculas co-estimuladoras en células dendríticas in vitro\ o

(¡II) modula positivamente la expresión de receptores inhibidores en células dendríticas in vitro.

6. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 4-5 en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo de ratón.

7. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, siendo dicho anticuerpo un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

8. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 5, en el que la región constante de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en una de las SEC ID N° 28 y 29.

9. El fragmento aislado de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es un fragmento de unión a antígeno seleccionado entre el grupo que consiste en un fragmento Fab y un fragmento F(ab')2.

10. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 4, en el que la región constante de cadena pesada es una reglón constante de cadena pesada de lgG1.

11. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 4, en el que dicha región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada humana.

12. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que al menos una de las regiones variables comprende restos flanqueantes humanos.

13. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 12, en el que uno o más de dichos restos de aminoácidos flanqueantes humanos está mutado en el resto de aminoácido murino correspondiente.

14. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo de cadena sencilla.

15. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una región constante de cadena ligera kappa o lambda.

16. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 15, en el que dicha región constante de cadena ligera es una cadena lamba.

17. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 15, en el que dicha región constante de cadena ligera es una cadena kappa.

18. Una composición que comprende el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto, que comprende administrar dichos anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a dicho sujeto de modo que se trate el cáncer en el sujeto.

20. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en: cáncer pancreático, melanomas, cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer de bronquios, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer cerebral o del sistema nervioso central, cáncer del sistema nervioso periférico, cáncer de esófago, cáncer cervical, cáncer de útero o endometrial, cáncer de la cavidad oral o faringe, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer testicular, cáncer del tracto biliar, cáncer del Intestino delgado o apéndice, cáncer de glándulas salivares, cáncer de glándula tiroides, cáncer de glándula suprarrenal, osteosarcoma, condrosarcoma, y un cáncer de un tejido hematológico.

21. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende:

la secuencia de nucleótidos mostrada complementarledad 1 (CDR1 de VH) de la la secuencia de nucleótidos mostrada complementarledad 2 (CDR2 de VH) de la la secuencia de nucleótidos mostrada complementariedad 3 (CDR3 de VH) de la la secuencia de nucleótidos mostrada complementariedad 1 (CDR1 de VL) de la la secuencia de nucleótidos mostrada complementariedad 2 (CDR2 de VL) de la la secuencia de nucleótidos mostrada complementarledad 3 (CDR3 de VL) de la en la que dicho anticuerpo o fragmento de

en la SEC ID N° 11, que codifica región variable de cadena pesada (VH); en la SEC ID N° 12, que codifica región variable de cadena pesada (VH); en la SEC ID N° 13, que codifica región variable de cadena pesada (VH); en la SEC ID N° 14, que codifica región variable de cadena ligera (VL); en la SEC ID N° 15, que codifica reglón variable de cadena ligera (VL); y en la SEC ID N° 16, que codifica región variable de cadena ligera (VL); unión a antígeno se une a ILT3 humano.

22. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 21 que comprende:

la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID N° 9, que codifica una reglón variable de cadena pesada; y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID N° 10, que codifica una reglón variable de cadena ligera.

23. Un vector de expresión recomblnante que comprende las moléculas de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 21-22.

24. Un vector de expresión recomblnante que comprende una o más moléculas nucleotídicas que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

25. Una célula hospedadora aislada en la que se ha Introducido el vector de expresión recombinante de la reivindicación 24.

26. Un método in vitro para producir un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a ILT3 humano, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 25 en un medio de cultivo hasta que se produzca un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se una a ILT3 humano por la célula.