Métodos y composiciones que comprenden aminoácidos no naturales.

Una composición que comprende a un polipéptido vinculado covalentemente a una molécula de ácido nucleico en una o más posiciones específicas de aminoácidos de aquel polipéptido,

donde aquella molécula de ácido nucleico está vinculada covalentemente a una cadena lateral de aminoácidos de un aminoácido codificado no naturalmente del polipéptido mencionado.

Métodos y composiciones que comprenden aminoácidos no naturales

Descripción

ANTECEDENTES DEL INVENTO 5

La capacidad para incorporar aminoácidos sin codificación genética (es decir, "aminoácidos no naturales") a proteínas hace posible la introducción de grupos funcionales químicos que pueden suministrar alternativas valiosas a los grupos funcionales que ocurren naturalmente, tales como la épsilon-NH2 de lisina, el sulfidrihilo -SH de cisteína, el grupo imino de histidina, etcétera. Ciertos grupos funcionales químicos son conocidos por ser inertes a los grupos 10 funcionales encontrados en los 20 aminoácidos comunes codificados genéticamente pero reaccionan en una forma ineficiente de para formar vínculos estables con grupos funcionales que pueden ser incorporados a los aminoácidos no naturales.

Existen métodos disponibles para inducir selectivamente grupos funcionales químicos que no se cuentan en 15 proteínas, que son químicamente inertes at todos los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos comunes codificados genéticamente y que pueden ser utilizados para reaccionar en forma eficiente y selectiva con ciertos grupos funcionales para formar enlaces covalentes estables.

RESUMEN DEL INVENTO 20

Aquí se describen métodos, composiciones, técnicas y estrategias para hacer, purificar, detectar, caracterizar y usar aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácidos no naturales y poli péptidos de aminoácidos no naturales modificados.

Este invento suministra una composición que contiene un polipéptido enlazado covalentemente de una molécula de ácido nucleico a una o más posiciones específicas de aminoácidos de aquel polipéptido, donde aquella molécula de ácido nucleico está enlazada en una forma covalente a una cadena lateral de aminoácidos de un aminoácido codificado no naturalmente de aquel polipéptido.

Aquí se presenta un método para detectar un polipéptido que involucra el detectar una cadena lateral de aminoácidos codificada no naturalmente del polipéptido. En algunas instancias, el polipéptido es sintetizado ribosómicamente. También se presenta métodos para detectar un polipéptido los cuales involucran el detectar una cadena lateral de aminoácidos codificada no naturalmente en el polipéptido que ha sido modificado después de su traducción. También se presentan métodos para detectar una cadena de aminoácidos codificada no naturalmente en 35 aquel polipéptido que involucra el contactar a la cadena lateral de aminoácidos codificada no naturalmente de una molécula que contiene un grupo funcional que interactúa específicamente con la cadena lateral de aminoácidos codificada no naturalmente. También se presentan métodos para purificar un polipéptido que tiene un aminoácido codificado no naturalmente de en la cadena del polipéptido. En algunas instancias, el método involucra el contactar el polipéptido con una sustancia que interactúa con la cadena lateral de aminoácidos codificada no naturalmente en 40 el polipéptido. En otras instancias, se presenta un método para purificar un polipéptido que tiene un aminoácido codificado no naturalmente en la cadena del polipéptido que involucra la precipitación del polipéptido, donde el aminoácido codificado no naturalmente altera la solubilidad del polipéptido cuando se compara a la solubilidad del polipéptido sin un aminoácido codificado no naturalmente en la cadena del polipéptido. Los métodos para purificar un polipéptido hecho en forma ribosómica que tiene un aminoácido codificado no naturalmente en la cadena lateral del 45 polipéptido involucra la electroforesis del polipéptido, donde el aminoácido codificado no naturalmente altera la movilidad electroforética del polipéptido cuando se lo compara con la movilidad electroforética del polipéptido sin un aminoácido codificado no naturalmente en la cadena del polipéptido. En otras instancias, el método para purificar un polipéptido hecho en forma ribosómica que tiene un aminoácido codificado no naturalmente de en la cadena lateral del polipéptido, incluye la diálisis del polipéptido, donde el aminoácido codificado no naturalmente altera la tasa de 50 difusión del polipéptido cuando se compara a la tasa de difusión del polipéptido sin un aminoácido codificado no naturalmente en la cadena del polipéptido.

También se presenta en este documento lo un método para examinar una biblioteca de moléculas, incluyendo: a) el combinar un polipéptido que contiene un aminoácido codificado no naturalmente con las moléculas 55 de la biblioteca bajo condiciones que permitan la interacción de las moléculas de la biblioteca con el polipéptido que contiene un aminoácido codificado no naturalmente, y b) identificar las moléculas de la biblioteca que interactúan con el polipéptido que contiene un aminoácido codificado no naturalmente. En algunas instancias, se examina una biblioteca de polipéptidos hechos en forma ribosómica que incluyen varios polipéptidos que tienen diferentes secuencias de aminoácidos, donde cada polipéptido incluye un aminoácido no natural. 60

También se presenta en este documento un método, que incluye: a) el sustituir un aminoácido codificado no naturalmente por un aminoácido codificado naturalmente en un sitio único preseleccionado en un polipéptido preseleccionado que tiene por lo menos una actividad biológica conocida; y b) el medir una actividad biológica del polipéptido preseleccionado que tiene al aminoácido codificado no naturalmente; y c) el comparar la actividad 65

biológica del polipéptido preseleccionado del paso b) con el polipéptido preseleccionado que tiene un aminoácido codificado no naturalmente sustituido por un aminoácido codificado naturalmente en una posición diferente en la cadena del polipéptido preseleccionado o con el polipéptido preseleccionado sin un aminoácido codificado no naturalmente sustituido en la cadena del polipéptido. En algunas ocasiones, un método para seleccionar una posición para una modificación después de la traducción de un polipéptido preseleccionado incluye a) el sustituir un 5 aminoácido codificado no naturalmente por un aminoácido codificado naturalmente en un lugar preseleccionado en un polipéptido preseleccionado que tiene por lo menos una actividad biológica conocida; y b) el medir una actividad biológica del polipéptido preseleccionado que tiene el aminoácido codificado no naturalmente; y c) el comparar la actividad biológica del polipéptido preseleccionado del paso b) con el polipéptido preseleccionado que tiene un aminoácido codificado no naturalmente de sustituido por un aminoácido codificado naturalmente en una posición 10 diferente de en la cadena del polipéptido preseleccionado o con el polipéptido preseleccionado sin un aminoácido codificado no naturalmente incluido en la cadena del polipéptido.

También se entiende que los métodos y composiciones aquí descritas no se limitan a la metodología, los protocolos, las líneas celulares, las estructuras y reactivos específicos aquí descritos y por tanto pueden variar 15 también. Se tiende que la terminología aquí usada es para propósitos de describir únicamente secciones específicas, y no tiene la intención de limitar el alcance de los métodos y composiciones aquí descritas, lo cual será limitado únicamente por las declaraciones adjuntas.

DEFINICIONES 20

Tal como se utiliza aquí y en las declaraciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" / "la" incluirán referencias en plural a menos que el con texto lo indique claramente de otra forma.

A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo 25 significado que es entendido comúnmente para una persona con conocimiento formal en la industria a la cual pertenecen los inventos aquí descritos. Aunque cualquier método, dispositivo y material similar o equivalente a aquellos aquí descritos puede ser utilizado en la práctica o para pruebas de los inventos aquí descritos, los métodos, dispositivos y materiales preferidos se describen ahora.

Todas las publicaciones y patentes aquí mencionadas son para propósitos de describir y presentar, por ejemplo, las estructuras y metodologías que se describen en las publicaciones, que podrían ser utilizadas en conexión con los inventos aquí descritos. Las publicaciones aquí descritas son suministradas solamente de para su información previa a la fecha de presentación de esta aplicación. Nada en este documento debe ser considerado como una admisión de que los inventores aquí mencionados tienen el derecho a pre - fechar aquella presentación 35 por virtud de un invento previo o por cualquier otra razón

Los... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones

1. Una composición que comprende a un polipéptido vinculado covalentemente a una molécula de ácido nucleico en una o más posiciones específicas de aminoácidos de aquel polipéptido, donde aquella molécula de ácido nucleico está vinculada covalentemente a una cadena lateral de aminoácidos de un aminoácido codificado no 5 naturalmente del polipéptido mencionado.

2. Una composición de acuerdo a la reivindicación 1, donde el ácido nucleico es ADN.

3. Una composición de acuerdo a la reivindicación 2, donde el ADN es un ADN de una sola cepa (ssDNA - 10 single stranded DNA) .

4. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, donde el polipéptido es un anticuerpo.