Composiciones de ARNt y usos de las mismas.

Composición que comprende un ARNt codificado por la secuencia de polinucleótido de la:

SEQ ID NO:1;SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; una secuencia de polinucleótido complementaria de la SEQ ID NO:1; una secuencia depolinucleótido complementaria de la SEQ ID NO:2; o una secuencia de polinucleótido complementaria de laSEQ ID NO:3.

Composiciones de ARNt y usos de las mismas

CAMPO DE LA PRESENTE INVENCIÓN

La invención concierne al campo de la bioquímica de la traducción. La invención se refiere a métodos de producción y composiciones de ARNt y usos de las mismas. La invención también se refiere a métodos para producir proteínas en células utilizando tal ARNt y composiciones relacionadas.

ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCIÓN

El código genético de cada organismo conocido, desde las bacterias hasta los seres humanos, codifica los mismos veinte aminoácidos comunes. Diferentes combinaciones de los mismos veinte aminoácidos naturales forman las proteínas que llevan a cabo prácticamente todos los complejos procesos de la vida, desde la fotosíntesis a la transducción de señales y la respuesta inmunitaria. Con el fin de estudiar y modificar la estructura y función de las proteínas, los científicos han tratado de manipular tanto el código genético como la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, ha sido difícil eliminar las limitaciones impuestas por el código genético que limitan las proteínas a veinte componentes básicos convencionales codificados genéticamente (con la rara excepción de la selenocisteína (véase, por ejemplo, A. Bock et al., (1991) , Molecular Microbiology 5:515-20) y la pirrolisina (véase, por ejemplo, Srinivasan, G, et al., (2002) , Science 296:1459-1462) .

Se han realizado algunos avances para eliminar estas limitaciones, aunque estos avances han sido limitados y la capacidad para controlar racionalmente la estructura y la función de las proteínas está todavía en ciernes. Por ejemplo, los químicos han desarrollado métodos y estrategias para sintetizar y manipular las estructuras de moléculas pequeñas (véase, por ejemplo, E.J. Corey y X.M. Cheng, The Logic of Chemical Synthesis (Wiley-Interscience, Nueva York, 1995) ) . La síntesis total (véase, por ejemplo, B. Merrifield, (1986) , Science 232:341-7 (1986) ) , y las metodologías de síntesis parcial (véase, por ejemplo, D.Y. Jackson et al., (1994) Science 266:243-7; y P.E. Dawson, y S.B. Kent, (2000) , Annual Review of Biochemistr y 69:923-60) , han hecho posible sintetizar péptidos y proteínas pequeñas, pero estas metodologías tienen una utilidad limitada con proteínas de más de 10 kilo Daltons (kDa) . Los métodos de mutagénesis, aunque potentes, están restringidos a un número limitado de cambios estructurales. En varios casos, ha sido posible incorporar competitivamente análogos estructurales cercanos de los aminoácidos comunes en las proteínas. Véase, por ejemplo, R. Furter, (1998) , Protein Science 7:419-26; K. Kirshenbaum, et al., (2002) , ChemBioChem 3:235-7; y V. Doring et al., (2001) , Science 292:501-4. La ligación química de péptidos y la ligación química nativa se describen en la patente de EE.UU. Nº 6.184.344, la publicación de patente de EE.UU. Nº 2004/0138412, la publicación de patente de EE.UU. Nº 2003/0208046, el documento WO 02/098902 y el documento WO 03/042235. Lu et al. en Mol. Cell. 2001 Oct; 8 (4) :759-69 describen un método en el que una proteína se liga químicamente a un péptido sintético que contiene aminoácidos no naturales (ligación de proteína expresada) .

Los primeros trabajos demostraron que la maquinaria de traducción de E. coli se adapta a aminoácidos de estructura similar a los veinte comunes. Véase Hortin, G., y Boime, I. (1983) Methods Enzymol. 96:777-784. Este trabajo se amplió adicionalmente relajando la especificidad de las sintetasas endógenas de E. coli para que activaran aminoácidos no naturales, así como su aminoácido natural afín. Por otra parte, se demostró que las mutaciones en los dominios de corrección de errores también podían utilizarse para ampliar el campo de los sustratos de la sintetasa endógena. Véase Doring, V., et al., (2001) Science 292:501-504. Sin embargo, estas estrategias se limitan a recodificar el código genético más que ampliar el código genético y conducir a grados variables de sustitución de uno de los veinte aminoácidos comunes con un aminoácido no natural.

Más tarde se demostró que pueden incorporarse aminoácidos no naturales de manera específica para el sitio en proteínas in vitro añadiendo ARNt supresores de ámbar ortogonales aminoacilados químicamente a una reacción de transcripción/traducción in vitro. Véase, por ejemplo, Noren, C. J, et al. (1989) Science 244:182-188; Bain, J.D., et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014; Dougherty D. A. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 645-652; Cornish, V. W, et al. (1995) Angew. Chem., Int. Ed. 34:621-633; J.A. Ellman, et al., (1992) , Science 255:197-200; y D. Mendel, et al., (1995) , Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 24:435-462. Estos estudios demuestran que el ribosoma y los factores de traducción son compatibles con un gran número de aminoácidos no naturales, incluso aquellos con estructuras inusuales. Lamentablemente, la aminoacilación química de los ARNt resulta difícil, y la naturaleza estequiométrica de este proceso limita seriamente la cantidad de proteína que podría generarse.

Se han microinyectado aminoácidos no naturales en células. Por ejemplo, se introdujeron aminoácidos no naturales en el receptor nicotínico de acetilcolina en ovocitos de Xenopus (por ejemplo, M.W. Nowak, et al. (1998) , In vivo incorporation of unnatural amino acids into ion channels in Xenopus oocyte expression system, Method Enzymol 293:504-529) mediante microinyección de un ARNt de Tetrahymena thermophila acilado químicamente de manera incorrecta (por ejemplo, M.E. Saks, et al. (1996) , An engineered Tetrahymena tRNAGln for in vivo incorporation of unnatural amino acids into proteins by nonsense suppression, J. Biol. Chem. 271:23169-23175) , y el ARNm pertinente. Véase, también, D. A. Dougherty (2000) , Unnatural amino acids as probes of protein structure and function, Curr. Opin. Chem. Biol. 4:645-652 y M.W. Nowak, P.C. Kearney J.R. Sampson, M.E. Saks, C.G. Labarca,

S.K. Silverman, W.G. Zhong, J. Thorson, J.N. Abelson, N. Davidson, P.G. Schultz, D.A. Dougherty y H.A. Lester, Science, 268:439 (1995) . Se inyecta conjuntamente un ovocito de Xenopus con dos especies de ARN producidas in vitro: un ARNm que codifica la proteína diana con un codón de terminación UAG en la posición de aminoácido de interés y un ARNt supresor de ámbar aminoacilado con el aminoácido no natural deseado. A continuación la maquinaria de traducción del ovocito inserta el aminoácido no natural en la posición determinada por el UAG. Lamentablemente, esta metodología está limitada a las proteínas de células que pueden ser microinyectadas, y debido a que el ARNt pertinente se acila químicamente in vitro, y no se puede volver a acilar, los rendimientos de proteína son muy bajos.

Para superar estas limitaciones, se añadieron nuevos componentes, por ejemplo, ARNt ortogonales, aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales y pares de los mismos, a la maquinaria de biosíntesis de proteínas del procariota Escherichia coli (E. coli) (véase, por ejemplo, L. Wang, et al., (2001) , Science 292:498-500) y el eucariota Sacchromyces cerevisiae (S. cerevisiae) (por ejemplo, J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003) ) lo que ha permitido incorporar in vivo aminoácidos codificados no genéticamente a proteínas. Mediante esta metodología, varios aminoácidos nuevos con propiedades químicas, físicas o biológicas novedosas, que incluyen marcadores de fotoafinidad y aminoácidos fotoisomerizables, aminoácidos de fotoentrecruzamiento (véase, por ejemplo, J.W. Chin, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 99:11020-11024; y Chin, J.W., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027) , cetoaminoácidos (véase, por ejemplo, Wang, L., et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 100:56-61 y Zhang, Z. et al., Biochem. 42 (22) :6735-6746 (2003) ) , aminoácidos que contienen un átomo pesado, y aminoácidos glicosilados, han sido incorporados a proteínas de manera eficaz y con elevada fidelidad en E. coli y en levadura en respuesta a, por ejemplo, el codón ámbar (TAG) . Véase, por ejemplo, J.W. Chin, y P.G. Schultz, (2002) , ChemBioChem 3 (11) :1135-1137 y L. Wang, y P.G. Schultz, (2002) , Chem. Comm, 1:1-11.

Se han presentado otros varios pares ortogonales. Se han descrito sistemas glutaminilo (véase, por ejemplo, Liu, D.R., y Schultz, P.G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96:4780-4785) , aspartilo (véase, por ejemplo, Pastrnak, M., et al., (2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286) , y tirosilo (véase, por ejemplo, Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem. (Tokio, Japón) 124:1065-1068, y Kowal, A.K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98:2268-2273) provenientes de ARNt y sintetasas de S. cerevisiae para la potencial incorporación... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende un ARNt codificado por la secuencia de polinucleótido de la: SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; una secuencia de polinucleótido complementaria de la SEQ ID NO:1; una secuencia de polinucleótido complementaria de la SEQ ID NO:2; o una secuencia de polinucleótido complementaria de la SEQ ID NO:3.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho ARNt está aminoacilado.

3. Composición según la reivindicación 2, en la que dicho ARNt está aminoacilado con un aminoácido codificado de forma no natural.

4. Composición según la reivindicación 3, en la que dicho aminoácido codificado de forma no natural es para-acetilfenilalanina.

5. Composición según la reivindicación 2, en la que dicho ARNt está aminoacilado químicamente.

6. Composición según la reivindicación 2, en la que dicho ARNt está aminoacilado enzimáticamente.

7. Composición según la reivindicación 6, en la que dicho ARNt es aminoacilado enzimáticamente por una RS o por una ribozima.

8. Composición según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una RS, en la que el ARNt está aminoacilado con un aminoácido.

9. Composición según la reivindicación 8, en la que dicho aminoácido es un aminoácido codificado de forma no natural.

10. Composición según la reivindicación 9, en la que dicho aminoácido codificado de forma no natural es para-acetilfenilalanina.

11. Composición según la reivindicación 1, en la que el ARNt proviene de un ARNt de Archael.

12. Composición según la reivindicación 1, en la que el ARNt proviene de M. janneschii.

13. Composición según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un sistema de traducción.

14. Composición según la reivindicación 13, en la que dicho sistema de traducción es un sistema de traducción libre de células.

15. Composición según la reivindicación 13, en la que dicho sistema de traducción es un lisado de células.

16. Composición según la reivindicación 13, en la que dicho sistema de traducción es un sistema reconstituido.

17. Composición según la reivindicación 13, en la que dicho sistema de traducción es un sistema de traducción celular.

18. Célula que comprende un sistema de traducción, en la que el sistema de traducción comprende el ARNt según la reivindicación 1.

19. Célula según la reivindicación 18, en la que la célula es una célula eucariota.

20. Célula según la reivindicación 19, en la que la célula eucariota es una célula de levadura, una célula fúngica, una célula de mamífero, una célula de insecto, o una célula vegetal.

21. Célula según la reivindicación 18, en la que la célula es una célula no eucariota.

22. Célula según la reivindicación 21, en la que la célula no eucariota es una célula de E. coli.

23. Célula según la reivindicación 18, que comprende adicionalmente un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, en la que el polinucleótido comprende un codón selector que es reconocido por el ARNt.

24. Célula según la reivindicación 23, en la que dicho polipéptido de interés es la hormona de crecimiento humana.

25. Célula que comprende el ARNt según la reivindicación 1, en la que dicha célula es una célula de E. coli, una célula de levadura, una célula fúngica, una célula de mamífero, una célula de insecto o una célula vegetal.

26. Vector que comprende un polinucleótido que codifica un ARNt, en el que dicho polinucleótido tiene la secuencia de ácido nucleico de la: SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; una secuencia de polinucleótido complementaria de la SEQ ID NO:1; una secuencia de polinucleótido complementaria de la SEQ ID NO:2; o una secuencia de polinucleótido complementaria de la SEQ ID NO:3.

27. Vector según la reivindicación 26, en el que el vector comprende un plásmido, un cósmido, un fago, o un virus.

28. Vector según la reivindicación 26, en el que el vector es un vector de expresión.

29. Célula que comprende el vector según la reivindicación 26.

30. Método para producir un polipéptido en una célula con un aminoácido seleccionado en una posición determinada, comprendiendo el método:

cultivar la célula en un medio apropiado, en el que la célula comprende un ácido nucleico que comprende al menos un codón selector y codifica una polipéptido; y proporcionar el aminoácido seleccionado; en el que la célula comprende adicionalmente:

un ARNt ortogonal (O-ARNt) que funciona en la célula y reconoce el codón selector, en el que dicho O-ARNt es codificado por la secuencia de polinucleótido de la: SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3, una secuencia de polinucleótido complementaria de la SEQ ID NO:1; una secuencia de polinucleótido complementaria de la SEQ ID NO:2; o una secuencia de polinucleótido complementaria de la SEQ ID NO:3, una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , en la que dicha O-RS aminoacila el O-ARNt con el aminoácido seleccionado.

31. Método según la reivindicación 30 en el que dicho aminoácido seleccionado es para-acetilfenilalanina.

32. Método según la reivindicación 30 en el que dicho polipéptido es la hormona de crecimiento humana.