Transcripción de arnt supresor en células de vertebrado.

Casete de transcripción de ARNt que comprende secuencias flanqueantes en 5' de un ARNt humano,

secuencias flanqueantes en 3' de un ARNt humano, un ARNt humano y uno o más ARNt de no mamífero, en el que el ARNt humano se encuentra cadena arriba del ARNt de no mamífero y en el que dicho casete comprende, en un orden de 5' a 3', (a) secuencia flanqueante en 5' de un ARNt humano, ARNt humano, secuencia flanqueante en 3' de un ARNt humano, y (b) uno o más de una unidad de transcripción de ARNt de no mamífero que comprende una secuencia flanqueante de ARNt humano en 5', un ARNt de no mamífero y una secuencia flanqueante de ARNt humano en 3'.

Transcripción de ARNt supresor en células de vertebrado

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención pertenece al campo de la bioquímica de traducción en células de vertebrado. La invención se refiere a métodos de producción y a composiciones de ARNt ortogonales, sintetasas ortogonales y pares de los mismos, en células de vertebrado. La invención también se refiere a composiciones de aminoácidos no naturales, proteínas y métodos de producción de proteínas en células de vertebrado que incluyen aminoácidos no naturales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El código genético de cada organismo conocido, desde las bacterias hasta los seres humanos, codifica los mismos veinte aminoácidos comunes. Las diferentes combinaciones de los mismos veinte aminoácidos naturales forman las proteínas que llevan a cabo prácticamente todos los complejos procesos de la vida, desde la fotosíntesis hasta la transducción de señales y la respuesta inmunitaria. Con el fin de estudiar y modificar la estructura y función de las proteínas, los científicos han tratado de manipular tanto el código genético como la secuencia de aminoácidos de las proteínas. Sin embargo, ha sido difícil eliminar las limitaciones impuestas por el código genético que limitan las proteínas a veinte bloques básicos estándar codificados genéticamente (con la rara excepción de la selenocisteína (véase, por ejemplo, A. Bock et al., (1991) , Molecular Microbiology 5:515-20) y la pirrolisina (véase, por ejemplo, G. Srinivasan, et al., (2002) , Science 296:1459-1462) .

Se han hecho algunos avances para eliminar estas limitaciones, aunque estos avances se han visto limitados, y la capacidad de controlar racionalmente la estructura y la función de las proteínas está todavía en ciernes. Por ejemplo, los químicos han desarrollado métodos y estrategias para sintetizar y manipular las estructuras de moléculas pequeñas (véase, por ejemplo, E.J. Corey y X. M. Cheng, The Logic of Chemical Synthesis (Wiley-Interscience, Nueva York, 1995) ) . La síntesis total (véase, por ejemplo, B. Merrifield, (1986) , Science 232:341-7 (1986) ) y las metodologías semisintéticas (véase, por ejemplo, D.Y. Jackson et al., (1994) Science 266:243-7, y P.E. Dawson y S.B. Kent, (2000) , Annual Review of Biochemistr y 69:923-60) , han hecho posible sintetizar péptidos y proteínas pequeñas, pero estas metodologías tienen una utilidad limitada con las proteínas de más de 10 kiloDaltons (kDa) . Los métodos de mutagénesis, aunque potentes, están restringidos a un número limitado de cambios estructurales. En varios casos, ha sido posible incorporar competitivamente en las proteínas análogos estructurales cercanos de los aminoácidos comunes. Véase, por ejemplo, R. Furter, (1998) , Protein Science 7:419-26; K. Kirshenbaum, et al., (2002) , ChemBioChem 3:235-7, y V. Doring et al., (2001) , Science 292:501-4.

En un intento de ampliar la capacidad de manipular la estructura y función de las proteínas, se desarrollaron métodos in vitro utilizando ARNt ortogonales químicamente acilados que permitían que se incorporasen selectivamente aminoácidos no naturales en respuesta a un codón sin sentido, in vitro (véase, por ejemplo, J.A. Ellman, et al., (1992) , Science 255:197-200) . Se incorporaron selectivamente a las proteínas aminoácidos con nuevas estructuras y propiedades físicas para estudiar el plegamiento y la estabilidad y el reconocimiento biomolecular y la catálisis de las proteínas. Véase, por ejemplo, D. Mendel, et al., (1995) , Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 24:435-462, y V.W. Cornish et al. (31 de marzo de 1995) , Angewandte Chemie-International Edition en inglés 34:621-633. Sin embargo, la naturaleza estequiométrica de este proceso limitaba seriamente la cantidad de proteína que podía generarse.

Se han microinyectado aminoácidos no naturales en células. Por ejemplo, se introdujeron aminoácidos no naturales en el receptor nicotínico de acetilcolina en ovocitos de Xenopus (por ejemplo, M.W. Nowak, et al. (1998) , In vivo incorporation of unnatural amino acids into ion channels in Xenopus oocyte expression system, Método Enzymol 293:504-529) mediante microinyección de un ARNt disaminoacilado químicamente de Tetrahymena thermophila (por ejemplo, M.E. Saks et al. (1996) , An engineered Tetrahymena tRNAGln for in vivo incorporation of unnatural amino acids into proteins by nonsense suppression, J. Biol. Chem., 271:23169-23175) y el ARNm correspondiente. Esto ha permitido estudios biofísicos detallados del receptor en ovocitos por la introducción de aminoácidos que contienen cadenas laterales con propiedades físicas o químicas únicas. Véase, por ejemplo, D.A. Dougherty (2000) , Unnatural amino acids as probes of protein structure and function, Curr. Opin. Chem. Biol. 4:645-652. Lamentablemente, esta metodología está limitada a las proteínas en células que pueden ser microinyectadas y dado que el ARNt pertinente se acila químicamente in vitro y no puede volver a acilarse, los rendimientos de proteína son muy bajos.

En el documento WO 2006/001832 se describe la expresión de ARNtTrp de B. subtilis en células T 293 humanas. Para potenciar la expresión de una secuencia de ARNtTrp de B. subtilis en las células, se insertó el gen entre las secuencias flanqueantes en 5’ y 3’ del gen de ARNtTrp de Arabidopsis.

Para superar estas limitaciones, se añadieron nuevos componentes a la maquinaria de biosíntesis de proteínas del procariota Escherichia coli (E. coli) (por ejemplo, L. Wang, et al., (2001) , Science 292:498-500) , lo que permitió la codificación genética de aminoácidos no naturales in vivo. Se han incorporado, de manera eficaz y con elevada fidelidad, varios nuevos aminoácidos con nuevas propiedades químicas, físicas o biológicas, incluidos marcadores de fotoafinidad y aminoácidos fotoisomerizables, aminoácidos ceto y aminoácidos glicosilados, en proteínas en E. coli en respuesta al codón ámbar, TAG, utilizando esta metodología. Véase, por ejemplo, J.W. Chin et al., (2002) , Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J.W. Chin y P.G. Schultz, (2002) , ChemBioChem 11:1135-1137; J.W. Chin, et al., (2002) , PNAS United States of America 99:11020-11024; y L. Wang y P.G. Schultz, (2002) , Chem. Comm., 1-10. Sin embargo, la maquinaria de traducción de procariotas y eucariotas, no está altamente conservada; por lo tanto, los componentes de la maquinaria biosintética añadidos a E. coli no pueden utilizarse con frecuencia para incorporar de manera específica de sitio aminoácidos no naturales en las proteínas en células de vertebrado. Por ejemplo, el par tirosil-ARNt sintetasa/ARNt de Methanococcus jannaschii que se utilizó en E. coli no es ortogonal en células de vertebrado. Además, la transcripción de ARNt en eucariotas, pero no en procariotas, es llevada a cabo por la ARN polimerasa III y esto impone restricciones a la secuencia primaria de los genes estructurales de ARNt que pueden transcribirse en células de vertebrado. Por otra parte, a diferencia de las células procariotas, los ARNt en células de vertebrado necesitan ser exportadas del núcleo, donde se transcriben, al citoplasma, para que funcionen en la traducción. Por último, el ribosoma 80S de vertebrados es distinto del ribosoma 70S procariota. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar componentes mejorados de la maquinaria biosintética para ampliar el código genético de vertebrados. La presente invención satisface estas y otras necesidades, como resultará evidente tras la revisión de la siguiente descripción.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un casete de transcripción de ARNt que comprende secuencias flanqueantes en 5’ de un ARNt humano, secuencias flanqueantes en 3’ de un ARNt humano, un ARNt humano y uno o más ARNt de no mamífero, en el que el ARNt humano se encuentra cadena arriba del ARNt de no mamífero y en el que el casete comprende, en un orden de 5’ a 3', (a) secuencia flanqueante en 5’ de un ARNt humano, ARNt humano, secuencia flanqueante en 3’ de un ARNt humano y (b) uno o más de una unidad de transcripción de ARNt de no mamífero que comprende una secuencia flanqueante en 5’ de ARNt humano, un ARNt de no mamífero y una secuencia flanqueante en 3’ de ARNt humano.

En algunas formas de realización de la invención, el ARNt de no mamífero reconoce un codón selector presente en un ARNm, preferentemente del grupo que consiste en un codón ámbar, ocre, ópalo o de cuatro bases, lo más preferentemente un ARNt supresor de ámbar. En una forma de realización preferente de la invención, el ARNt de no mamífero es de Escherichia coli.

En algunas formas de realización de la invención,... [Seguir leyendo]

1. Casete de transcripción de ARNt que comprende secuencias flanqueantes en 5’ de un ARNt humano, secuencias flanqueantes en 3’ de un ARNt humano, un ARNt humano y uno o más ARNt de no mamífero, en el que el ARNt humano se encuentra cadena arriba del ARNt de no mamífero y en el que dicho casete comprende, en un orden de 5’ a 3', (a) secuencia flanqueante en 5’ de un ARNt humano, ARNt humano, secuencia flanqueante en 3’ de un ARNt humano, y (b) uno o más de una unidad de transcripción de ARNt de no mamífero que comprende una secuencia flanqueante de ARNt humano en 5’, un ARNt de no mamífero y una secuencia flanqueante de ARNt humano en 3'.

2. Casete de transcripción de ARNt según la reivindicación 1, en el que dicho ARNt de no mamífero reconoce un codón selector presente en un ARNm.

3. Casete de transcripción de ARNt según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ARNt de no mamífero reconoce un codón selector seleccionado del grupo que consiste en un codón ámbar, ocre, ópalo o de cuatro bases.

4. Casete de transcripción de ARNt según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARNt de no mamífero es un ARNt supresor de ámbar.

5. Casete de transcripción de ARNt según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARNt de no mamífero es de Escherichia coli.

6. Casete de transcripción de ARNt según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARNt humano es Tyr ARNt humano.

7. Célula o línea celular de vertebrado que comprende el casete de transcripción de ARNt según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.