ARNt Supresor hibrido en células de vertebrados.

Una célula de vertebrado o una línea celular que comprende una secuencia de nucleótidos descrita en la SEC ID Nº 87 o en la SEC ID Nº 88,

en la que la célula no es una célula madre embrionaria humana o una célula humana in vivo y la línea celular no es una línea celular madre embrionaria humana.

ARNt Supresor hibrido en células de vertebrados

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención pertenece al campo de la traducción bioquímica en células de vertebrados. La invención se refiere a métodos y composiciones para producir ARNs de transferencia (ARNts) ortogonales, sintetasas ortogonales y pares de los mismos, en células de vertebrados. La invención también se refiere a composiciones de aminoácidos no naturales, proteínas y métodos de producción de proteínas en células de vertebrados que incluyen aminoácidos no naturales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El código genético de cada organismo conocido, desde bacterias hasta humanos, codifica los mismos veinte aminoácidos comunes. Las diferentes combinaciones de los mismos veinte aminoácidos naturales de proteínas llevan a cabo todos los procesos complejos de la vida, desde la fotosíntesis hasta la transducción de señal y la respuesta inmune. Para estudiar y modificar la estructura y la función de las proteínas, los científicos han intentado manipular tanto el código genético como la secuencia aminoácida de proteínas. Sin embargo, ha sido complicado eliminar las limitaciones impuestas por el código genético, que limita las proteínas a veinte unidades estructurales estándares genéticamente codificadas, con la rara excepción de la selenocisteína (véase, por ejemplo,

A. Bock et al., (1991) , Molecular Microbiology 5: 515 – 20) y la pirrolisina (véase, por ejemplo, G. Srinivasa, et al., (2002) , Science 296: 1459 – 62) .

Se han realizado algunos progresos para eliminar estas limitaciones, aunque este progreso es limitado, y la capacidad de controlar racionalmente la estructura y la función de proteínas está todavía sin desarrollar. Por ejemplo, algunos químicos han desarrollado métodos y estrategias para sintetizar y manipular las estructuras de moléculas pequeñas (véase, por ejemplo, E. J. Corey, & X. - M. Cheng, The logic of chemical synthesis (Wiley – Interscience, New York, 1995) ) . La síntesis total (véase, por ejemplo, B. Merrifield, (1986) , Science 232: 341 – 7 (19686) ) , y las metodologías semisintéticas (véanse, por ejemplo, D. Y. Jackson et al., (1994) Science 266: 243 – 7; y P. E. Dawson, & S. B. Kent, (2000) , Annual Review of Biochemistr y 69: 923 – 60) , han hecho posible sintetizar péptidos y proteínas pequeñas, pero estas metodologías tienen utilidad limitada respecto a las proteínas de unos 10 kilo daltons (kDa) . Los métodos de mutagénesis, aunque potentes, se limitan a un número restringido de cambios estructurales. En diversos casos, ha sido posible incorporar competitivamente análogos de aminoácidos comunes estructuralmente cercanos mediante proteínas. Véanse, por ejemplo, R. Further, (1998) , Protein Science 7: 419 – 26;

K. Kirshenbaum, et al., (2002) , ChemBioChem 3: 235 – 7; y V. Doring et al., (2001) , Science 292: 501 – 4.

En un intento de expandir la capacidad de manipular la función y la estructura de proteínas, se han desarrollado métodos in vitro que utilizan ARNts ortogonales acilados químicamente que permiten a los aminoácidos no naturales incorporarse selectivamente en respuesta a un codón antisentido, in vitro (véase, por ejemplo, J. A. Ellman, et al., (1992) , Science 255: 197 – 200) . Los aminoácidos con nuevas estructuras y propiedades físicas se incorporaron selectivamente a proteínas para estudiar el plegamiento y la estabilidad proteicos y el reconocimiento y la catálisis biomolecular. Véase, por ejemplo, D. Mendel, et al., (1995) , Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 24: 435 - 462; y, V. W. Cornish, et al. (Mar. 31, 1995) , Angewandte Chemie - International Edición en Inglés 34: 621 – 633. Sin embargo, la naturaleza estoicométrica de este proceso ha limitado severamente la cantidad de proteína que podría generarse.

Los aminoácidos no naturales se microinyectaron en células. Por ejemplo, se introdujeron aminoácidos no naturales en el receptor nicotínico de acetilcolina en oocitos de Xenopus (por ejemplo, M. W. Nowak, et al., (1998) , In vivo incorporation of unnatural amino acids into ion channels in Xenopus oocyte expression system, Method Enzymol. 293: 504 – 529) mediante la microinyección de un ARNt disaminoacilado químicamente de Tetrahymena thermophila (por ejemplo, M. E. Saks, et al., (1996) , An engineered Tetrahymena tRNAGIn for in vivo incorporation of unnatural amino acids into proteins by nonsense suppression, J. Biol. Chem. 271: 23169 – 23175) , y el ARNm relevante. Esto ha permitido estudios biofísicos detallados del receptor en oocitos mediante la introducción de aminoácidos que incluyen cadenas laterales con propiedades físicas o químicas únicas. Véase, por ejemplo, D. A. Dougherty (2000) , Unnatural amino acids as probes of protein structure and function, Curr. Opin. Chem. Biol. 4: 645

– 652. Desafortunadamente, esta metodología se limita a proteínas en células que pueden microinyectarse y, debido a que el ARNt relevante es acilado químicamente in vitro y no puede reacetilarse, los rendimientos de las proteínas son muy bajos.

Para superar estas limitaciones, se añadieron nuevos componentes a la maquinaria biosintética de la proteína del organismo procariota Escherichia coli (E. coli) (por ejemplo, L. Wang, et al., (2001) , Science 292: 498 – 500) que permitieron la codificación genética de aminoácidos no naturales in vivo. Se añadieron eficientemente y con alta fidelidad numerosos aminoácidos nuevos con propiedades químicas, físicas o biológicas nuevas, incluyendo marcadores de fotoafinidad y aminoácidos fotoisomerizables, cetoaminoácidos y aminoácidos glicosilados a proteínas de E. coli en respuesta al codón ámbar, TAG, utilizando esta metodología. Véanse, por ejemplo, J. W.

Chin et al., (2002) , Journal of the American Chemical Society 124: 9026 – 9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002) , ChemBioChem 11: 1135 – 1137; J. W. Chin, et al., (2002) , PNAS United States of America 99: 11020 – 11024; y L. Wang, & P. G. Schultz, (2002) , Chem. Comm. 1 – 10. Sin embargo, la maquinaria translacional de procariotas y eucariotas no se conserva muy bien; por lo tanto, los componentes de la maquinaria biosintética añadida a E. coli no pueden utilizarse a menudo para incorporar específicamente en el sitio aminoácidos no naturales en proteínas de células de vertebrados. Por ejemplo, el par tirosil - ARNt sintetasa / ARNt de Methanococcus jannaschii que se utilizó, en E. coli no es ortogonal en las células de vertebrados. Además, la transcripción de ARNt en eucariotas, pero no en procariotas, se lleva a cabo por ARN polimerasa III, y esto supone restricciones en la secuencia primaria de los genes estructurales del ARNt que pueden transcribirse en células de vertebrados. Además, a diferencia de las células procariotas, los ARNts en las células de vertebrados necesitan exportarse desde el núcleo, donde se transcriben, hasta el citoplasma, para funcionar en la traducción. Finalmente, el ribosoma 80S del vertebrado es diferente del ribosoma 70S procariótico. Por lo tanto, es necesario desarrollar componentes mejorados de la maquinaria biosintética para expandir el código genético en vertebrados. La presente invención cubre tanto esta como otras necesidades, como se verá reflejado en el análisis de la presente divulgación.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona células de vertebrados, en las que la célula de vertebrado no es una célula madre embrionaria humana o una célula humana in vivo, con componentes de traducción, por ejemplo, pares de aminoacil

– ARNt sintetasas ortogonales (O – RSs) y ARNts ortogonales (O – tRNAs con una secuencia como la descrita en la SEC ID Nº 87) y componentes individuales de los mismos, que se emplean en la maquinaria biosintética de las proteínas de vertebrados para incorporar un aminoácido no natural en una cadena polipeptídica cultivada en una célula de vertebrado.

Las composiciones de la invención incluyen una célula de vertebrado (por ejemplo, una célula de mamífero, una célula aviar, una célula de pez, una célula de reptil, una célula de anfibio, células derivadas de animales no mamíferos, etc.) que comprende una aminoacil – ARNt sintetasa ortogonal (O – RS) (por ejemplo, derivada de un organismo no vertebrado, como Escherichia coli, Bacillus stearothermophilus, etc.) , en la que la O – RS aminoacila, preferentemente, al ARNt ortogonal con una secuencia como la descrita en la SEC ID Nº 87 (O – tRNA) con, al menos, un aminoácido no natural en la célula de vertebrado. Opcionalmente,... [Seguir leyendo]

1. Una célula de vertebrado o una línea celular que comprende una secuencia de nucleótidos descrita en la SEC ID Nº 87 o en la SEC ID Nº 88, en la que la célula no es una célula madre embrionaria humana o una célula humana in vivo y la línea celular no es una línea celular madre embrionaria humana.

2. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una molécula de ARNt que tiene una secuencia de reconocimiento de anticodones específica para un codón selectivo.

3. La célula de la reivindicación 2, en la que el codón selectivo se selecciona del grupo formado por: codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, y codones de cuatro o más bases.

4. La célula de la reivindicación 2, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una molécula de ARNt capaz de ser aminoacilada con al menos un aminoácido no natural.

5. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una molécula de ARNt que es un ARNt ortogonal (O – tRNA) .

6. La célula de la reivindicación 5, en la que el O – tRNA es capaz de aminoacilarse con un aminoácido natural o un aminoácido no natural.

7. La célula de la reivindicación 4, en la que el O – tRNA es capaz de aminoacilarse con un aminoácido natural o un aminoácido no natural.

8. La célula de la reivindicación 5, en la que el O – tRNA es capaz de aminoacilarse con un aminoácido no natural.

9. La línea celular de la reivindicación 1, en la que la línea celular ha sido transfectada de manera estable.

10. La línea celular de la reivindicación 1, en la que la línea celular ha sido transfectada de manera transitoria.

11. Un procedimiento para producir una célula de vertebrado, en la que la célula no es una célula madre embrionaria humana o una célula humana in vivo, en la que al menos una proteína comprende al menos un aminoácido no natural, comprendiendo el procedimiento:

cultivar en un medio apropiado, dicha célula de vertebrado que comprende un ácido nucleico que comprende al menos un codón selectivo y codifica a la proteína; en el que el medio comprende un aminoácido no natural y la célula de vertebrado comprende: un O – tRNA que tiene una secuencia de nucleótidos descrita en la SEC ID Nº 87 o en la SEC ID Nº 88 que funciona en la célula y reconoce al codón selectivo; y una aminoacil - ARNt sintetasa ortogonal (O – RS) que aminoacila preferentemente el O – tRNA con el aminoácido no natural.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la célula ha sido transfectada de forma estable para comprender el O – tRNA y laO – RS.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la célula ha sido transfectada de forma transitoria para comprender el O – tRNA y laO – RS.

14. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la célula ha sido transfectada de forma estable para comprender el O – tRNA y la O – RS y ha sido transfectada de forma transitoria para comprender al O – tRNA y a la O – RS.

15. El procedimiento de la reivindicación 11 o la célula de la reivindicación 8, en el que se selecciona un aminoácido no natural del grupo formado por: p – acetil -L - fenilalanina, p – yodo - L - fenilalanina, O - metil - L-tirosina, p - propargiloxifenilalanina, L –.

3. (2 - naftil) alanina.

3. metil - fenilalanina, O .

4. alil – L tirosina.

4. propil – L - tirosina, tri – O - acetil - GlcNAcβ - serina, L - Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil- L - fenilalanina, p -azido - L - fenilalanina, p –acil - L - fenilalanina, ap – benzoílo -L - fenilalanina, L fosfoserina, fosfonoserina, fosfonotirosina, p - bromofenilalanina, p - amino - L - fenilalanina, un análogo no natural de un aminoácido de tirosina; un análogo no natural de un aminoácido de glutamina; un análogo no natural de un aminoácido de fenilalanina; un análogo no natural de un aminoácido de serina; un análogo no natural de un aminoácido de treonina; un alquilo, arilo, acilo, azida, ciano, halo , hidrazina, hidrazida, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, sulfonilo, selenio, éster, tioácido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterociclo, enona, imina, aldehído, hidroxilamina, ceto, o aminoácidos de amino sustituido, o cualquier combinación de los mismos; un aminoácido con un reticulador fotoactivable; un aminoácido marcado en spin; un aminoácido fluorescente; un aminoácido de unión a metales; un aminoácido que

contiene un metal; un aminoácido radiactivo; un aminoácido fotobloqueado y / o fotoisomerizado; una biotina o biotina - analóga que contiene aminoácidos, un aminoácido que contiene ceto; un aminoácido que comprende polietilenglicol o poliéter; un aminoácido sustituido de átomo pesado; un aminoácido químicamente escindible o fotoescindible; un aminoácido con una cadena lateral alargada; un aminoácido que contiene un grupo tóxico; un aminoácido de azúcar sustituido; un aminoácido que contiene azúcar enlazada al carbono; un amino ácido activo de redox; un ácido que contiene α -hidroxi; un ácido tioaminado; un α , ácido α amino disustituido; un ácido β - amino, un aminoácido cíclico que no sea prolina o histidina, y un aminoácido aromático distinto a la fenilalanina, tirosina o triptófano.

16. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la proteína comprende una proteína terapéutica, una proteína de diagnóstico, una enzima industrial o una parte de las mismas.

17. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la proteína o polipéptido de interés comprende una proteína o una parte de una proteína seleccionada del grupo formado por: una citocina, un factor de crecimiento, un receptor del factor de crecimiento, un interferón, una interleucina, una molécula inflamatoria, un producto oncogénico, una hormona peptídica, una molécula de transducción de señales, un receptor de la hormona esteroide, una eritropoyetina (EPO) , una insulina, una hormona del crecimiento humano, una alfa - 1 antitripsina, una angiostatina, un factor antihemolítico, un anticuerpo, una apolipoproteína, una apoproteína, un factor natriurético atrial, un polipéptido natriurético atrial, un péptido atrial, una quimiocina C

– X - C, T39765 , NAP - 2 , ENA -78, Gro - a, Gro - b, Gro - c, IP- 10, GCP- 2, PNA - 4, SDF - 1, PF4, MIG, una calcitonina, un ligando de c - kit, una quimiocina CC, una proteína quimiotáctica de monocitos - 1, una proteína quimiotáctica de monocitos - 2, una proteína quimioatrayente de monocitos - 3, proteína- 1 alfa inflamatoria de monocitos, proteína -1 beta inflamatoria de monocitos, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, un ligando CD40, un colágeno, un factor estimulante de colonias (CSF) , un factor del complemento 5a, un inhibidor del complemento, receptor 1 del complemento, DHFR, un péptido epitelial activador de los neutrófilos 78, GROα / MGSA, GROβ, GROγ, un MIP -1α, MIP – 1δ, MCP

- I, un factor de crecimiento epidérmico (EGF) , un péptido epitelial activador de neutrófilos, una toxina exfoliante, un factor IX, un factor VII, un factor VIII, un factor X, un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) , un fibrinógeno, una fibronectina, G-CSF, GM-CSF, una glucocerebrosidasa, una gonadotropina, una proteína Hedgehog, una hemoglobina, un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , una hirudina, una albúmina de suero humano, ICAM – 1, un receptor ICAM – 1, un LFA – 1, un receptor LFA – 1, una insulina, un factor de crecimiento de tipo insulina (IGF) , IGF – II, un IFN – α, un IFN – β, un IFN – γ, una IL - 1, una IL

- 2, una IL - 3, una IL - 4, una IL - 5, una IL - 6, una IL - 7, una IL - 8, una IL - 9, una IL - 10, una IL - 11, una IL - 12, un factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) , una lactoferrina, un factor inhibidor de leucemia, una luciferasa, una neurturina, un factor inhibidor de neutrófilos (NIF) , una oncostatina M, una proteína osteogénica, una hormona paratiroidea, PD - ECSF, PDGF, una pleyotropina, una proteína A, una proteína G, exotoxinas pirogénicas A, B , y C, una relaxina, una renina, SCF, un receptor I soluble del complemento, un soluble I - CAM 1, receptores solubles de interleucina, un receptor soluble de TNF, una somatomedina, una somatostatina, una somatotropina, una estreptoquinasa, superantígenos, enterotoxinas estafilocócicas SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, un receptor de hormona esteroide, un superóxido dismutasa (SOD) , una toxina del síndrome de shock tóxico, una timosina alfa 1, un activador plasminógeno tisular, un factor de crecimiento tumoral (TGF) , un TGF – α, un TGF – β, un factor de necrosis tumoral, un factor de necrosis tumoral – alfa, un factor de necrosis tumoral beta, un receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) , una proteína VLA – 4, una proteína VCAM – 1, un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGEF) , uroquinasa, Mos , Ras, Raf, Met, p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Rel, un receptor de estrógeno, un receptor de progesterona, un receptor de testosterona, un receptor de aldosterona, un receptor LDL, un SCF / c - Kit, CD40L / CD40, VLA -4 / VCAM - 1, ICAM – 1 / LFA - 1, una hialurina / CD44, y una corticosterona.

18. Un kit para producir una proteína que comprende, al menos, un aminoácido no natural, comprendiendo el kit: un recipiente que contiene una secuencia de polinucleótidos descrita en la SEC ID Nº 87 o en la SEC ID Nº 88.

19. El kit de la reivindicación 18, en el que el kit comprende además, al menos, un aminoácido no natural.

20. El kit de la reivindicación 18, en el que el kit comprende además materiales informativos para la producción de proteínas.