Método de producción de anticuerpos recombinantes contra tumores.

Uso de un anticuerpo G250 para la fabricación de una formulación farmacéutica para el tratamiento de pacientes de carcinoma de células renales después de la cirugía,

en donde el anticuerpo G250 es producido por la célula de hibridoma DSM ACC 2526 o una célula de progenie de la misma, en donde la célula de progenie se ha obtenido por transferencia de material genético codificante del anticuerpo G250 o al menos el sitio de fijación de antígeno del mismo a una célula receptora.

Método de producción de anticuerpos recombinantes contra tumores La invención se refiere a la célula de hibridoma G250 o cualquier célula de progenie de la misma capaz de producir el anticuerpo G250.

La fusión de células de mieloma de ratón con las células del bazo de ratones inmunizados, descrita por primera vez por Kohler y Milstein, Nature, 256, 495â?"997 (1975) , hace posible obtener líneas continuas de células que producen anticuerpos homogéneos, a los que se hace referencia como anticuerpos monoclonales (mAb) .

Existen muchos ejemplos en los que se describen células híbridas o hibridomas. Estos hibridomas se utilizan para producir anticuerpos útiles para diversas investigaciones científicas (Current Topics in Microbiology and Immunology, 10 volumen 81 â?" "Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers et al., Springerâ?"Verlag (1978) y las referencias citadas en dicho lugar; C.J. Barnstable et al., Cell, (1978) , 14, 9â?"20; P. Parham, W.F. Bodmer, Nature (1978) , 276, 397â?"399; Handbook of Experimental Immunology, 3ª edición, vol. 2, D.M. Wier, editor, Blackwell, 1978, capítulo 25, Chem. Eng. News, 15â?"17 (1979) ; Kennett, R.H., McKearn, J.T. y Bechtol, K.B. (1980) Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis (Plenum, Nueva York) ) . Estos informes describen las técnicas principales 15 para la producción de anticuerpos monoclonales por hibridomas.

El anticuerpo monoclonal G250, subclase IgG1, reconoce un antígeno expresado preferentemente en las membranas de las células de carcinoma de células renales (RCC) que no se expresa en el epitelio tubular proximal normal. El anticuerpo G250 se obtuvo por inmunización de un ratón con homogeneizados de células procedentes de lesiones RCC primarias obtenidas de diferentes pacientes (Oosterwijk et al., Int. J. Cancer 38 (1986) , 489â?"494) . 20

El anticuerpo monoclonal G250 así como derivados quiméricos del mismo se han utilizado en estudios clínicos (Steffens et al., J. Clin. Oncol. 15 (1997) , 1529â?"1537; Steffens et al., Clinical Cancer Research 5 (1999) , 32681-32741) . La secuencia de ácido nucleico que codifica el sitio de fijación de antígeno de G250 es el asunto de la solicitud US también en tramitación No. 60/266853, que se incorpora en esta memoria por referencia.

La producción de una línea de células de hibridoma que expresa el anticuerpo G250 se describió en líneas 25 generales en la solicitud de patente internacional WO88/08854 y Oosterwijk et al., (supra) . Como se ha indicado anteriormente, se utilizó como inmunógeno un homogeneizado de células procedente de lesiones RCC primarias obtenidas de diferentes pacientes y por tanto un material inespecífico. Adicionalmente, la línea de células de hibridoma no había sido depositada en una institución depositaria reconocida de acuerdo con el Tratado de Budapest. Así pues, no parece que sea posible una reproducción exacta de la línea de células de hibridoma G250 a 30 partir de los documentos de la técnica anterior disponibles públicamente.

Entretanto, se ha encontrado que el anticuerpo G250 se fija al denominado antígeno MN que se describe, v.g., en WO93/18152. Sin embargo, el sitio de fijación de G250 en el antígeno MN no se conoce actualmente. Además, resultados recientes demuestran que el sitio de fijación de G250 es un epítopo de conformación, lo cual aumenta adicionalmente la dificultad para reproducir la línea de células de hibridoma G250, dado que no puede 35 proporcionarse ninguna secuencia epitópica especificada en el antígeno MN que se fije a G250.

Así, la presente invención se refiere a una célula de hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal G250. Esta célula de hibridoma fue depositada de acuerdo con el Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos en fecha 11 de septiembre de 2001 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemania, bajo el Número de Acceso DSM 40 ACC 2526. El depósito es la primera descripción públicamente disponible de una línea de células de hibridoma productora del anticuerpo G250.

Un aspecto adicional de la invención es una célula de progenie derivada de dicho hibridoma DSM ACC 2526 que produce un anticuerpo G250.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a una célula de progenie de la célula de hibridoma 45 depositada que produce un anticuerpo G250 en donde la célula de progenie se obtiene por métodos de DNA recombinante, v.g., por transferencia de material genético que codifica el anticuerpo G250 o al menos el sitio de fijación de antígeno del mismo a una célula receptora. El material genético puede obtenerse directa o indirectamente de la célula de hibridoma G250 depositada. "Obtenido directamente" significa que el material genético G250 se deriva de la célula de hibridoma depositada. "Obtenido indirectamente" significa que el material genético G250 se 50 deriva de una célula de progenie G250 ya existente o de otras fuentes con inclusión de la síntesis química.

Preferiblemente, el material genético G250 comprende secuencias de nucleótidos que codifican al menos el sitio de fijación de antígeno de G250, particularmente secuencias de nucleótidos que codifican las regiones determinantes complementarias CDR3, CDR2 y/o CDR1 del sitio de fijación de antígeno de la cadena pesada como se muestra en la Figura 1 (designado H1â?"H3) y/o las regiones determinantes complementarias CDR3, CDR2 y/o CDR1 del sitio de 55 sitio de fijación de antígeno de la cadena ligera (designado L1â?"L3) como se muestra en la Figura 1.

De acuerdo con la invención, el término "anticuerpo G250" abarca cualquier anticuerpo con inclusión de anticuerpos multiespecíficos (v.g. anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo con tal que los mismos exhiban la actividad deseada, es decir, al menos un sitio de fijación de antígeno de G250. El anticuerpo puede ser un anticuerpo IgM, IgG (v.g. IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) , IgD, IgA o IgE, particularmente un anticuerpo IgG, un anticuerpo recombinante o un fragmento de anticuerpo obtenido por métodos proteolíticos o por métodos de DNA 5 recombinante.

El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones existentes naturalmente que pueden estar presentes en cantidades relativamente pequeñas. 10

El término "anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a cualquier polipéptido que contenga al menos un sitio de fijación de antígeno de G250, es decir al menos la región CDR3 de la cadena pesada de G250 y/o la región CDR3 de la cadena ligera de G250 o una región variante CDR3 de G250 que tiene una identidad de al menos 80%, con preferencia al menos 90% con la región CDR3 de G250 original al nivel de aminoácidos, con la condición de que la región variante CDR3 tiene características de fijación de antígeno equivalentes, particularmente 15 afinidad y especificidad comparadas con la región CDR3 original.

Preferiblemente, el término "anticuerpo" empleado en esta memoria incluye anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y totalmente humanizados, anticuerpos monocatenarios, v.g. fragmentos de anticuerpo sFv, fragmentos de diacuerpos, fragmentos de anticuerpos proteolíticos o recombinantes tales como fragmentos Fv, Fab, Fab' o F (ab') 2 u otras subsecuencias de anticuerpos fijadores de antígeno. El anticuerpo puede ser también una 20 fusión o un conjugado con otras entidades.

Los anticuerpos de esta memoria incluyen específicamente anticuerpos quiméricos en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera que incluye el sitio de fijación de antígeno es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes derivadas de la línea de células de hibridoma G250 original, mientras que el resto de las cadenas es idéntico u homogéneo a secuencias correspondientes derivadas de otras especies o pertenecientes a otra clase o 25 subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos con tal que los mismos exhiban la actividad biológica deseada. Más preferiblemente, el anticuerpo quimérico comprende regiones variables, v.g. las regiones determinantes del complemento (CDRs) y las regiones marco de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo monoclonal G250 original y secuencias humanas constantes, particularmente secuencias humanas constantes de cadena ligera kappa y cadena pesada gamma. La fabricación de anticuerpos quiméricos ha sido descrita v.g. por 30 Morrison et al. (Proc. Natl. Acad.... [Seguir leyendo]

1. Uso de un anticuerpo G250 para la fabricación de una formulación farmacéutica para el tratamiento de pacientes de carcinoma de células renales después de la cirugía, en donde el anticuerpo G250 es producido por la célula de hibridoma DSM ACC 2526 o una célula de progenie de la misma, en donde la célula de progenie se ha obtenido por transferencia de material genético codificante del anticuerpo G250 o al menos el sitio de fijación de antígeno del 5 mismo a una célula receptora.

2. El uso de la reivindicación 1 para el tratamiento de metástasis después de cirugía de tumores.

3. Uso de un anticuerpo G250 para la fabricación de un agente para provocar una respuesta inmune retardada en pacientes de cáncer más de seis meses después del comienzo de la terapia en el tratamiento del carcinoma de células renales, en donde el anticuerpo G250 es producido por la célula de hibridoma DSM ACC 2526 o una célula 10 de progenie de la misma, en donde la célula de progenie se ha obtenido por transferencia de material genético codificante del anticuerpo G250 o al menos el sitio de fijación de antígeno del mismo a una célula receptora.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo totalmente humano, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo de cadena simple o un fragmento de anticuerpo F (ab') 2, Fab', o Fab. 15

5. El uso de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico G250 como tal.

6. El uso de la reivindicación 5, en donde la formulación farmacéutica comprende un anticuerpo quimérico G250 acoplado a una citocina tal como IL-2, TNF y/o GM-CSF.

7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el ácido nucleico codificante del anticuerpo G250 comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2. 20

8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el ácido nucleico codificante del anticuerpo G250 comprende

a) una secuencia de nucleótidos que codifica las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2, y/o CDR3 del sitio de fijación de antígeno de la cadena pesada como se muestra en la Figura 1, designado H1-H3, y en SEQ ID NO: 1, y/o 25

b) una secuencia de nucleótidos que codifica las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2, y/o CDR3 del sitio de fijación de antígeno de la cadena ligera como se muestra en la Figura 1, designado L1-L3, y en SEQ ID NO: 2.

9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el anticuerpo G250 comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, y 30 en donde el anticuerpo se fija selectivamente al antígeno G250.

10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el anticuerpo G250 comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2, y CDR3 como se muestra en Fig. 1 o al menos la región CDR3 de la cadena pesada de G250 o una región CDR3 de G250 variante que tiene una identidad de secuencia de al menos 80%, preferiblemente 90% con la 35 región CDR3 de la cadena pesada de G250 original como se muestra en Fig. 1 al nivel de aminoácidos y/o (b) una región variable de cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2, y CDR3 como se muestra en Fig. 1 o al menos la región CDR3 de la cadena ligera de G250 o una región CDR3 variante de G250 que tiene una identidad de secuencia de al menos 80%, preferiblemente 90% con la región CDR3 de la cadena ligera de G250 original como se muestra en Fig. 1 al nivel de aminoácidos, 40

en donde dicha región variante CDR3 de la cadena pesada y/o de la cadena ligera tiene características equivalentes de fijación de antígeno comparada con la región CDR3 original.

11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde los pacientes tienen enfermedad progresiva.

12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde los pacientes eran refractarios a la terapia previa con citocinas o quimioterapia, o habían sufrido recidiva (s) después de tratamiento con citocinas. 45