Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen Eg5.

Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen Eg5 humano en una célula,

en donde dicho ARNbc comprende al menos dos secuencias que son complementarias entre sí y en donde una hebra sentido comprende una primera secuencia y una hebra antisentido comprende una segunda secuencia que comprende una región de complementariedad que es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica Eg5, en donde dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, en donde dicha parte de un ARNm que codifica Eg5 consiste en la secuencia UCGAGAAUCUAAACUAACU, y en donde dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho Eg5, inhibe la expresión de dicho gen Eg5.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/065636.

Solicitante: ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 300 THIRD STREET CAMBRIDGE, MA 02142 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: VORNLOCHER,HANS-PETER, GEICK,ANKE, Tan,Pamela, BUMCROT,DAVID.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01N43/04 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01N CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES O DE PARTES DE ELLOS (conservación de alimentos o productos alimenticios A23 ); BIOCIDAS, p. ej. EN TANTO QUE SEAN DESINFECTANTES, PESTICIDAS O HERBICIDAS (preparaciones de uso médico, dental o para el aseo que eliminan o previenen el crecimiento o la proliferación de organismos no deseados A61K ); PRODUCTOS QUE ATRAEN O REPELEN A LOS ANIMALES; REGULADORES DEL CRECIMIENTO DE LOS VEGETALES (mezclas de pesticidas con fertilizantes C05G). › A01N 43/00 Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen compuestos heterocíclicos (que contienen anhídridos cíclicos, imidas cíclicas A01N 37/00; que contienen compuestos de fórmula , que no tienen más que un heterociclo en los que m ≥ 1 y n ≥ 0 y es una pirrolidina, una piperidina, una morfolina, una tiomorfolina, una piperazina o una polimetilenoimina, no sustituida o sustituida por un alcoilo, que tiene al menos cuatro grupos CH 2 A01N 33/00 - A01N 41/12; que contienen ácidos ciclopropanocarbhoxílicos o sus derivados, p. ej. ésteres con heterociclos, A01N 53/00). › con un heteroátomo.
  • A61K31/70 A […] › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Hidratos de carbono; Azúcares; Sus derivados (sorbitol A61K 31/047).
  • C07H21/02 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con ribosilo como radical sacárido.
  • C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N15/11 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).

PDF original: ES-2544861_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen Eg5 Solicitudes reiacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional en EE UU No. 60/787.762, presentada el 31 de marzo, 2006 y la solicitud provisional en EE UU No. 60/870.259, presentada el 15 de diciembre, 2006.

Campo de ¡a invención

Esta solicitud se refiere a ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), y su uso en mediar interferencia por ARN para inhibir la expresión del gen Eg5 y el uso del ARNbc para tratar procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5, tal como cáncer, solo o en combinación con un ARNbc que se dirige al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Antecedentes de ia invención

El mantenimiento de las poblaciones celulares en un organismo está regido por los procesos celulares de división celular y muerte celular programada. En células normales, los sucesos celulares asociados con el inicio y terminación de cada proceso están muy regulados. En enfermedad proliferativa, tal como cáncer, uno o ambos de estos procesos pueden estar alterados. Por ejemplo, una célula cancerosa puede haber perdido su regulación (control de los puntos de control) del ciclo de división celular mediante bien la sobreexpresión de un regulador positivo o la pérdida de un regulador negativo, tal vez por mutación.

Alternativamente, una célula cancerosa puede haber perdido su capacidad de experimentar muerte celular programada mediante la sobreexpresión de un regulador negativo. Por tanto, hay una necesidad para desarrollar nuevos fármacos quimioterapéuticos que restaurarán los procesos de control de los puntos de control y muerte celular programada a las células cancerosas.

Un enfoque para el tratamiento de cánceres humanos es dirigirse a una proteína que es esencial para la progresión del ciclo celular. Para que el ciclo celular prosiga de una fase a la siguiente, se deben completar ciertos sucesos prerrequisitos. Hay puntos de control en el ciclo celular que imponen el orden apropiado de sucesos y fases. Uno de tales puntos de control es el punto de control del huso que se produce durante la fase de metafase de la mitosis. Las moléculas pequeñas que se dirigen a proteínas con funciones esenciales en mitosis pueden promover que el punto de control del huso detenga las células en mitosis. De las moléculas pequeñas que paran las células en mitosis, las que muestran actividad antitumoral en clínica también inducen apoptosis, los cambios morfológicos asociados con la muerte celular programada. Un agente quimioterapéutico eficaz para el tratamiento del cáncer puede por tanto, ser uno que induzca el control de un punto de control y muerte celular programada. Desafortunadamente, hay pocos compuestos disponibles para controlar estos procesos dentro de la célula. La mayoría de los compuestos que se sabe causan parada mitótica y apoptosis actúan como agentes de unión a tubulina. Estos compuestos alteran la inestabilidad dinámica de los microtúbulos e indirectamente alteran la función/estructura del huso mitótico causando de esta manera parada mitótica. Puesto que la mayoría de estos compuestos se dirigen específicamente a la proteína tubulina que es un componente de todos los microtúbulos, también pueden afectar a uno o más de los numerosos procesos celulares normales en los que los microtúbulos desempeñan un papel. Por tanto, también hay una necesidad para moléculas pequeñas que se dirijan más específicamente a proteínas asociadas con células en proliferación.

Eg5 es una de varias proteínas motoras similares a cinesina que están localizadas en el huso mitótico y que se sabe se requieren para la formación y/o función del huso mitótico bipolar. Recientemente, hubo un artículo de una molécula pequeña que altera la bipolaridad del huso mitótico (Mayer, T. U. et. al. 1999. Science 286(5441) 971-4, incorporado en el presente documento mediante referencia). Más específicamente, la molécula pequeña indujo la formación de un huso mitótico anómalo en donde una matriz monoastral de microtúbulos emanaba de un par central de centrosomas, con los cromosomas unidos a los extremos distales de los microtúbulos. La molécula pequeña se llamó "monastrol" por el haz monoastral. Este fenotipo de haz monoastral se había observado previamente en células mitóticas que tenían la proteína motora Eg5 inmunológicamente disminuida. Este fenotipo de haz monoastral distintivo facilitó la identificación de monastrol como un inhibidor potencial de Eg5. En efecto, se mostró además que monastrol inhibe la motilidad dirigida por Eg5 de los microtúbulos en un ensayo in vitro. El inhibidor de Ég5 monastrol no tenía efecto aparente sobre el motor cinesina relacionado o sobre el/los motor(es) responsables del movimiento del aparato de golgi en la célula. Las células que muestran el fenotipo de haz monoastral bien por la disminución inmunológica de Eg5 o inhibición de Eg5 por monastrol se detienen en la fase M del ciclo celular. Sin embargo, la parada mitótica inducida por la disminución inmunológica o inhibición de Eg5 es transitoria (Kapoor, T. M., 2000. J Cell Biol 150(5) 975-80). Tanto el fenotipo de haz monoastral como la parada del ciclo celular en mitosis inducidas por monastrol son reversibles. Las células se recuperan para formar un huso mitótico bipolar normal, para completar la mitosis y seguir a través del ciclo celular y proliferación celular normal. Estos datos sugieren que un inhibidor de molécula pequeña de Eg5 que inducía una parada mitótica transitoria puede no ser eficaz para el

tratamiento de la proliferación de células cancerosas. No obstante, el descubrimiento de que monastrol produce parada mitótica es Intrigante y por tanto hay una necesidad para estudiar e Identificar adlclonalmente compuestos que se pueden usar para modular la proteína motora Eg5 de una manera que fuera eficaz en el tratamiento de cánceres humanos. También hay una necesidad para explorar el uso de estos compuestos con otros agentes antineopláslcos.

VEGF (también conocido como factor de permeabilidad vascular, VPF) es una cltoqulna multlfunclonal que estimula la anglogénesls, proliferación de células epiteliales, y supervivencia de células endotellales. VEGF se puede producir por una amplia variedad de tejidos, y su sobreexpresión o expresión anómala puede producir una variedad de trastornos, Incluyendo cánceres y trastornos de retina tal como la degeneración macular senil y otros trastornos anglogénlcos.

Recientemente, se ha mostrado que moléculas de ARN bicatenarlo (ARNbc) bloquean la expresión génica en un mecanismo regulador muy conservado conocido como interferencia por ARN (¡ARN). El documento WO 99/32619 (Flre et al.) divulga el uso de un ARNbc de al menos 25 nucleótidos de longitud para inhibir la expresión de genes en C. e/egans. También se ha mostrado que el ARNbc degrada el ARN diana en otros organismos, incluyendo plantas (véase, por ejemplo, el documento WO 99/53050, Waterhouse et al.; y el documento WO 99/61631, Heifetz et al ), Drosop/?//a (véase, por ejemplo, Yang, D., et al., Curr. B/o/. (2000) 10:1191-1200), y mamíferos (véase, el documento WO 00/44895, Llmmer; y el documento DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.). Este mecanismo natural se ha convertido ahora en el foco para el desarrollo de una nueva clase de agentes farmacéuticos para tratar trastornos que están causados por la regulación anómala o ¡ndeseada de un gen.

A pesar de los avances significativos en el campo de la ¡ARN y avances en el tratamiento de procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5, permanece una necesidad para un agente que pueda silenciar selectiva y eficazmente el gen Eg5 usando el propia maquinarla de ¡ARN de la célula que tiene tanto alta actividad biológica como estabilidad ¡n vivo, y que pueda Inhibir eficazmente la expresión de un gen Eg5 diana para su uso en tratar procesos patológicos mediados por la expresión Eg5.

Compendio de la Invención

La invención se define en las reivindicaciones

La Invención se refiere a ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), así como composiciones y métodos in vitro para inhibir la expresión del gen Eg5 en una célula o mamífero usando tal ARNbc, solo o en combinación con un ARNbc que se dirige a VEGF. La Invención también proporciona composiciones y métodos para tratar estados patológicos y enfermedades causadas por la expresión del gen Eg5, tal como en cáncer. El ARNbc de la invención comprende una hebra de ARN (la hebra antlsentido) que tiene una región que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud, y es totalmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARNm del gen Eg5, dicha parte es como se define en... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen Eg5 humano en una célula, en donde dicho ARNbc comprende al menos dos secuencias que son complementarias entre sí y en donde una hebra sentido comprende una primera secuencia y una hebra antisentido comprende una segunda secuencia que comprende una región de complementariedad que es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica Eg5, en donde dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, en donde dicha parte de un ARNm que codifica Eg5 consiste en la secuencia UCGAGAAUCUAAACUAACU, y en donde dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho Eg5, inhibe la expresión de dicho gen Eg5.

2. El ARNbc de la reivindicación 1, en donde dicha primera secuencia es la secuencia de SEQID NO: 135 y dicha segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 136.

3. El ARNbc de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado.

4. El ARNbc de la reivindicación 3, en donde dicho nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido modificado con 2'-0-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato, un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico, un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desox¡, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato, y un nucleótido que comprende una base no natural.

5. Una célula /n v/fro que comprende el ARNbc de la reivindicación 1.

6. Una composición farmacéutica para inhibir la expresión del gen Eg5 que comprende el ARNbc de la reivindicación 1 o 2.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, que comprende además un ARNbc que inhibe la expresión del gen VEGF.

8. Un método /n v/fro para inhibir la expresión del gen Eg5 en una célula, comprendiendo el método:

(a) introducir en la célula el ARNbc de la reivindicación 2; y

(b) mantener la célula producida en el paso (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm del gen Eg5, inhibiendo de esta manera la expresión del gen Eg5 en la célula.

9. El método de la reivindicación 8 en donde un segundo ARNbc que inhibe la expresión de VEGF se introduce en dicha célula.

10. Un ARNbc de la reivindicación 1 o 2 para tratar, prevenir o controlar procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5.

11. El ARNbc de la reivindicación 10, en donde se va a administrar un segundo ARNbc que inhibe la expresión de VEGF.

12. Un vector para inhibir la expresión del gen Eg5 en una célula, comprendiendo dicho vector una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una hebra de un ARNbc, en donde una de las hebras de dicho ARNbc es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica Eg5, en donde dicho ARNbc tiene menos de 30 pares de bases de longitud, en donde dicha parte de un ARNm que codifica Eg5 consiste en la secuencia UCGAGAAUCUAAACUAACU, y en donde dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho Eg5, inhibe la expresión de dicho gen Eg5 al menos en un 40%.

13. Una célula /n v/fro que comprende el vector de la reivindicación 12.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, el método de la reivindicación 9, o el ARNbc de la reivindicación 11, en la medida en que dichas reivindicaciones se refieren a la reivindicación 2, en donde el ARNbc que inhibe la expresión de VEGF consiste en una hebra sentido y una antisentido, consistiendo dicha hebra sentido en la secuencia GcAcAuAGGAGAGAuGAGCUsU, consistiendo dicha hebra antisentido en la secuencia AAGCUcAUCUCUCCuAuGuGCusG, en donde A, G, C y U representan ribonucleótidos; c y u representan 2-O-metil ribonucleótidos; y s representa fosforotioato.


 

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