Un agente de iRNA aislado que comprende una cadena sentido constituida por SEQ ID NO: 267 y una cadena antisentido constituida por SEQ ID NO: 268.

Modulación de RNAi de RSV y usos terapéuticos del mismo.

CAMPO TÉCNICO

La invención se refiere al campo de la terapia del virus respiratorio sincitial (RSV) y composiciones y métodos para modulación de la replicación viral, y más particularmente a la regulación decreciente de uno o más genes de un virus respiratorio sincitial por oligonucleótidos vía RNA de interferencia que se administran localmente a los pulmones y al conducto nasal por inhalación intranasal o sistémicamente por inyección intravenosa.

ANTECEDENTES

En virtud de su función natural, el tracto respiratorio está expuesto a un gran número de patógenos transportados por el aire que causan una diversidad de enfermedades respiratorias. La infección viral del tracto respiratorio es la causa más común de hospitalización infantil en el mundo desarrollado con un número estimado de 91.000 admisiones anuales en los Estados Unidos a un coste de 300 millones de dólares. El virus respiratorio sincitial humano (RSV) y el virus de la parainfluenza (PIV) son los dos agentes principales de enfermedad respiratoria; juntos, infectan los tractos respiratorios superior e inferior, conduciendo a crup, neumonía y bronquiolitis (Openshaw, P.J.M. Respir. Res. 3 (Suppl 1) , S15-S20 (2002) , Easton, A.J., et al., Clin. Microbiol. Rev. 17, 390-412 (2004) ) . El RSV por sí solo infecta hasta el 65% de los bebés dentro del primer año de vida, y prácticamente a todos dentro de los dos primeros años. Es también una causa importante de morbilidad y mortalidad en los ancianos. La inmunidad después de infección de RSV no es completa ni duradera, y por consiguiente, ocurren infecciones repetidas en todos los grupos de edad. Los niños pequeños que sufren bronquiolitis por RSV son más propensos a desarrollar respiración sibilante y asma posteriormente a lo largo de su vida. La investigación para tratamiento eficaz y vacuna contra RSV ha estado en curso durante aproximadamente cuatro décadas con poco éxito (Openshaw, P.J.M. Respir. Res. 3 (Suppl 1) , S15-S20 (2002) , Maggon, K. et al, Rev. Med. Virol. 14, 149-168 (2004) ) . En la actualidad no está aprobada clínicamente ninguna vacuna para cualquiera de las variedades de RSV. Cepas de ambos virus existen también para animales no humanos tales como ganado vacuno, cabras, cerdos y ovejas, causando pérdidas en la agricultura y las industrias lácteas y cárnicas (Easton, A.J. et al., Clin. Microbiol. Rev. 17, 390-412 (2004) ) .

Ambos RSV contienen genomas de RNA no segmentados de cadena negativa y pertenecen a la familia Paramyxoviridae. Cierto número de características de estos virus han contribuido a las dificultades de prevención y terapia. Los genomas virales mutan a una tasa elevada debido a la falta de un mecanismo de lectura de pruebas de la replicación de los genomas de RNA, presentando un enfrentamiento significativo el diseño de una vacuna o agente antiviral fiable (Sullender, W.M. Clin. Microbiol. R ev. 13, 1-15 (2000) ) . Los inhibidores prometedores de la proteína de fusión de RSV (F) fueron abandonados en parte debido a que el virus desarrollaba mutaciones resistentes que se mapeaban en el gen F (Razinkov, V., et. al., Antivir. Res. 55, 189-200 (2002) , Morton, C.J. et al. Virology 311, 275-288 (2003) ) . Ambos virus se asocian con proteínas celulares, lo que aumenta la dificultad de obtención de material viral exento de células para la vacunación (Burke, E., et al., Virology 252, 137-148 (1998) , Burke, E., et al., J. Virol . 74, 669-675 (2000) , Gupta, S., et al., J. Virol. 72, 2655-2662 (1998) ) . Finalmente, la inmunología de ambos, y especialmente la de RSV, es sumamente compleja (Peebles, R.S., Jr., et al., Viral. I mmunol. 16, 25-34 (2003) , Haynes, L.M., et al., J. Virol. 77, 9831-9844 (2003) ) . El uso de proteínas de RSV desnaturalizadas como vacunas conduce a "inmunopotenciación" o enfermedad intensificada por la vacuna (Polack, F.P. et al. J. Exp. Med. 196, 859-865 (2002) ) . El problema global se subraya por el reciente cierre de cierto número de programas biofarmacéuticos anti-RSV.

El genoma del RSV comprende una cadena simple de RNA de sentido negativo que tiene una longitud de 15222 nucleótidos y produce 11 proteínas principales. (Falsey, A. R, y E. E. Walsh, 2000, Clinical Microbiological Reviews 13:371-84) . Dos de estas proteínas, las glicoproteínas F (fusión) y G (fijación) son las proteínas principales de la superficie y las más importantes para inducción de inmunidad protectora. La proteína SH (hidrófoba pequeña) , la proteína M (matriz) y la proteína M2 (22 kDa) están asociadas con la envoltura viral pero no inducen una respuesta inmune protectora. Las proteínas N (proteína principal asociada a la nucleocápsida) , P (fosfoproteína) , y L (proteína principal de polimerasa) se encuentran asociadas con el RNA del virión. Las dos proteínas no estructurales, NS1 y NS2, participan probablemente en la interacción hospedador-virus, pero no están presentes en los viriones infecciosos.

Las cepas de RSV humano se han clasificado en dos grupos principales, A y B. Se ha demostrado que la glicoproteína G es la más divergente entre las proteínas del RSV. La variabilidad de la glicoproteína G del RSV entre y dentro de los dos grupos RSV se cree es importante para la capacidad del RSV de causar brotes anuales de enfermedad. La glicoproteína G comprende 289-299 aminoácidos (dependiendo de la cepa de RSV) , y tiene una estructura de tallo intracelular, transmembranal, y altamente glicosilada de 90 kDa, así como dominios de fijación de heparina. La glicoproteína existe en formas secretadas y fijadas a la membrana.

Actualmente no se dispone de métodos satisfactorios de tratamiento de la infección RSV (Maggon K y S. Barik, 2004, Reviews in Medical Virology 14:149-68) . La infección del tracto respiratorio inferior con RSV es una afección auto-limitante en la mayoría de los casos. No existen líneas orientativas o criterios definitivos en cuanto al modo de tratamiento o el momento de ingresar o dar de alta a los niños pequeños y muchachos que padecen la enfermedad. La hipoxia, que puede ocurrir en asociación con la infección RSV, puede tratarse con oxígeno vía una cánula nasal. La ventilación mecánica para muchachos con insuficiencia respiratoria, choque, o apnea recurrente puede reducir la mortalidad. Algunos médicos prescriben esteroides. Sin embargo, varios estudios han demostrado que la terapia con esteroides no afecta al curso clínico de los niños y muchachos ingresados en el hospital con bronquiolitis. Así, los corticosteroides, solos o en combinación con broncodilatadores, pueden ser inútiles en el tratamiento de la bronquiolitis en pacientes sanos por lo demás y no ventilados. En niños pequeños y muchachos con enfermedades cardiopulmonares subyacentes, tales como disfasia broncopulmonar y asma, se han utilizado también esteroides.

La ribavirina, un análogo de guanosina con actividad antiviral, ha sido utilizada para tratar niños pequeños y muchachos con bronquiolitis por RSV desde mediados de los años 1980, pero muchos estudios de evaluación de su uso han dado resultados conflictivos. En la mayoría de los centros, el uso de ribavirina está restringido en la actualidad a pacientes inmunodeficientes y a aquéllos que están gravemente enfermos.

La gravedad de la bronquiolitis por RSV ha sido asociada con concentraciones bajas de retinol sérico, pero pruebas realizadas en muchachos hospitalizados con bronquiolitis por RSV han demostrado que el suplemento de vitamina A no proporciona efecto beneficioso alguno. Pruebas terapéuticas de 1500 mg/kg de inmunoglobulina de RSV intravenosa o 100 mg/kg de inmunoglobulina inhalada para la infección por RSV del tracto respiratorio inferior no han conseguido tampoco demostrar efectos beneficiosos sustanciales.

En los países desarrollados, el tratamiento de la infección del tracto respiratorio inferior por RSV está limitado generalmente a terapia sintomática. La terapia antiviral se limita usualmente a situaciones amenazantes para la vida debido a su elevado coste y a la falta de consenso en cuanto a la eficacia. En los países en desarrollo, el oxígeno es la terapia principal (cuando está disponible) , y la única vía para reducir la mortalidad es la basada en prevención.

El RNA de interferencia o "RNAi" es un término acuñado inicialmente por Fire y colaboradores para describir la observación de que el RNA bicatenario (dsRNA) puede bloquear la expresión génica cuando se introduce en gusanos (Fire et al., Nature 391:806-811, 1998) . El dsRNA corto dirige la silenciación específica de genes y posterior a la transcripción en muchos... [Seguir leyendo]

1. Un agente de iRNA aislado que comprende una cadena sentido constituida por SEQ ID NO: 267 y una cadena antisentido constituida por SEQ ID NO: 268.

2. El iRNA de la reivindicación 1, que comprende un fosforotioato o un nucleótido modificado en 2'.

3. El iRNA de la reivindicación 2, en el cual el nucleótido modificado en 2' comprende una modificación seleccionada del grupo constituido por: nucleótidos modificados co.

2. desoxi.

2. fluoro.

2. O-metilo.

2. O-metoxietilo.

2. amino .

2. aminoalcoxi.

4. El iRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente un ligando.

5. Una formulación farmacéutica que comprende un agente de iRNA, siendo el agente de iRNA citado como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y en el cual dicha formulación comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

6. La formulación de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente un agente terapéutico además del agente de iRNA citado.

7. La formulación de la reivindicación 6, en el cual dicho agente terapéutico es un segundo agente de iRNA anti-RSV.

8. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el cual

(a) el agente de iRNA citado se encuentra en fase acuosa;

(b) dicha formulación es al menos parcialmente cristalina, uniformemente cristalina, o anhidra; o

(c) dicha formulación es un polvo.

9. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el cual dicha formulación comprende un agente estabilizador de iRNA seleccionado del grupo constituido por un formador de quelatos y un inhibidor de las RNAsas.

10. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el cual dicho portador farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo constituido por

(a) un polipéptido;

(b) un aminoácido;

(c) un carbohidrato seleccionado del grupo constituido por un monosacárido, disacárido, o polisacárido; y

(d) PBS.

11. La formulación de la reivindicación 5, en el cual dicha formulación es estéril, exenta de pirógenos, y comprende de uno a quince por ciento en peso de una sal fisiológicamente aceptable.

12. La formulación de la reivindicación 5, en el cual dicha formulación es una partícula respirable

(a) de aproximadamente 1 a 10 micrómetros de tamaño; o

(b) de aproximadamente 10 a 500 micrómetros de tamaño.

13. La formulación de la reivindicación 5, en el cual dicha formulación es para administración directa a los pulmones

o al conducto nasal a una dosis comprendida entre 1 y 150 mg.

14. Un agente de iRNA como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en el tratamiento o la prevención de la infección de RSV en un individuo mamífero.

15. El agente de iRNA para uso en el tratamiento o la prevención de la infección de RSV de la reivindicación 14, en el cual el agente de iRNA citado debe administrarse

(a) por vía intranasal a un individuo, o

(b) por vía local a los pulmones de dicho individuo.

16. El agente de iRNA para uso en el tratamiento o la prevención de la infección de RSV de la reivindicación 14 ó 15, en el cual el agente de iRNA citado debe administrarse por inhalación o nebulización a un individuo.

17. El agente de iRNA para uso en el tratamiento o la prevención de una infección de RSV de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el cual debe co-administrarse a dicho individuo un segundo agente de iRNA, y en el cual dicho segundo agente de iRNA comprende una cadena sentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos o más complementarios a

(a) un segundo gen de dicho virus respiratorio o

(b) un segmento del gen N de RSV, siendo dicho fragmento diferente del segmento constituido por la

secuencia de SEQ ID NO: 267; y una cadena antisentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos o más complementarios a dicha cadena sentido.

18. El agente de iRNA para uso en el tratamiento o la prevención de la infección de RSV de la reivindicación 17, en el cual dicho segundo agente comprende 15 nucleótidos o más seleccionados de uno de los agentes de la Tabla 1 (a-c) .

19. El agente de iRNA para uso en el tratamiento o la prevención de una infección de RSV de la reivindicación 17, 5 en el cual se ha diagnosticado que el individuo sufre una infección viral con dicho virus respiratorio de mamífero.

20. Un dispositivo que comprende un agente de iRNA como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o constituido por la formulación farmacéutica que se define en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13 para generar una suspensión de aerosol o de partículas respirables, en el cual el dispositivo es un nebulizador accionado a presión, un nebulizador ultrasónico, o un generador terapéutico de aerosoles sólido particulado.

21. El dispositivo de la reivindicación 20, en el cual el generador terapéutico de aerosoles sólido particulado es un insuflador; o un inhalador de dosis medidas.