Agentes iRNA que tienen como diana al VEGF.

Un agente iRNA aislado, que comprende una secuencia sentido y una secuencia antisentido,

en el que lassecuencias sentido y antisentido forman un dúplex de RNA, y en el que la secuencia antisentido comprende unasecuencia nucleotídica suficientemente complementaria a una secuencia diana de alrededor de 19 a 23 nucleótidosde una secuencia nucleotídica de VEGF, y en el que dicha secuencia diana difieren no más de 1, 2 ó 3 nucleótidosde la secuencia de SEC ID NO: 344.

Agentes iRNA que tienen como diana al VEGF

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención pertenece al campo de agentes iRNA que pueden inhibir la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . Se describe el uso de secuencias de siRNA que tienen como diana a VEGF para tratar afecciones o trastornos relacionados con la expresión indeseada de VEGF, por ejemplo degeneración macular relacionada con la edad o retinopatía diabética.

ANTECEDENTES

VEGF (también conocido como factor de permeabilidad vascular, VPF) es una citocina multifuncional que estimula la angiogénesis, la proliferación de células epiteliales, y la supervivencia de células endoteliales. VEGF se puede producir mediante una amplia variedad de tejidos, y su sobreexpresión o expresión aberrante puede dar como resultado una variedad de trastornos, incluyendo trastornos retinianos tales como degeneración macular relacionada con la edad y retinopatía diabética, cáncer, asma, y otros trastornos angiogénicos.

La degeneración macular es una causa principal de ceguera en los Estados Unidos de América, y la frecuencia de este trastorno aumenta con la edad. Degeneración macular se refiere al grupo de enfermedades en las que las células que perciben la visión en la zona macular de la retina funcionan mal o pierden función, y pueden dar como resultado una pérdida debilitante de la visión central vital o de la visión detallada. La degeneración macular del adulto (AMD) , que es la forma más habitual de degeneración macular, se produce en dos formas principales. El noventa por ciento de personas con AMD tiene la forma descrita como degeneración macular “seca”. Se ve afectada un área de la retina, lo que conduce a la ruptura lenta de células en la mácula, y a una pérdida gradual de la visión central. La otra forma de AMD es degeneración macular “húmeda”. Aunque sólo el 10% de las personas con AMD tienen este tipo, da cuenta del 90% de ceguera de la enfermedad. A medida que AMD seca avanza, comienzan a crecer nuevos vasos sanguíneos y provocar AMD “húmeda”. Estos nuevos vasos sanguíneos pierden a menudo sangre y fluido bajo la mácula. Esto provoca un daño rápido a la mácula, lo que puede conducir a la pérdida de visión central en un espacio de tiempo corto. Los agentes iRNA que tienen como diana a VEGF pueden ser útiles para el tratamiento de degeneración macular húmeda y seca.

La interferencia con RNA o “RNAi” es la expresión inicialmente acuñada por Fire y colaboradores para describir la observación de que el RNA bicatenario (dsRNA) puede bloquear la expresión génica cuando se introduce en gusanos (Fire et al., Nature 391:806-811, 1998) . dsRNA corto dirige el silenciamiento post-transcripcional, específico de genes, en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la función génica. Se ha sugerido RNAi como un método para desarrollar una nueva clase de agentes terapéuticos. Sin embargo, hasta la fecha, estos han permanecido mayoritariamente como sugerencias, sin prueba demostrada de que RNAi se puede usar terapéuticamente.

La presente invención da un paso en la técnica al proporcionar un paseo génico detallado a lo largo del gen de VEGF y un análisis estructural detallado de modificaciones que se pueden emplear para estabilizar la molécula frente a la degradación e incrementar la captación celular y selección de dianas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona compuestos, composiciones y métodos como se definen en las reivindicaciones y útiles para modular la expresión de VEGF. La invención proporciona compuestos, composiciones y métodos útiles para modular la expresión de la actividad de VEGF mediante interferencia con RNA (RNAi) usando pequeñas moléculas de ácidos nucleicos, tales como moléculas de RNA corto de interferencia (siRNA) , RNA bicatenario (dsRNA) , microRNA (miRNA) y RNA de horquilla corto (shRNA) , que caen colectivamente bajo el término general de agentes iRNA. Los agentes iRNA pueden ser moléculas de ácidos nucleicos sin modificar o químicamente modificadas. Los agentes iRNA se pueden sintetizar químicamente o expresar a partir de un vector, o se pueden sintetizar enzimáticamente. La invención proporciona diversos agentes iRNA sintéticos químicamente modificados capaces de modular la expresión o actividad del gen de VEGF en células y en mamífero mediante RNAi. El uso de un agente iRNA químicamente modificado puede mejorar una o más propiedades de un agente iRNA a través de una mayor resistencia a la degradación, mayor especificidad para seleccionar como dianas a restos, captación celular mejorada, y similar.

Se describe un agente iRNA que reduce la expresión de un gen de VEGF. El gen de VEGF puede incluir una secuencia codificante de VEGF y/o secuencias reguladoras de VEGF, tales como pueden existir 5’ o 3’ de un marco de lectura abierto (ORF) de VEGF.

En una realización, la invención proporciona un agente iRNA aislado, como se define en las reivindicaciones, y que incluye una secuencia sentido y antisentido, en el que las secuencias sentido y antisentido pueden formar un dúplex de RNA. En particular, la invención proporciona un agente iRNA aislado, que comprende una secuencia sentido y una secuencia antisentido, en el que las secuencias sentido y antisentido forman un dúplex de RNA, y en el que la secuencia antisentido comprende una secuencia nucleotídica suficientemente complementaria a una secuencia diana de alrededor de 19 a 23 nucleótidos de una secuencia nucleotídica de VEGF, y en el que dicha secuencia diana difiere en no más de 1, 2 ó 3 nucleótidos de la secuencia de SEC ID NO: 344. La secuencia sentido puede incluir una secuencia nucleotídica que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia diana de alrededor de 19 a 23 nucleótidos de una secuencia de VEGF. Se describe que la secuencia de VEGF que se selecciona como diana incluye la secuencia de una cualquiera de SEC ID NOs:2-401 (véase Tabla 1) .

La secuencia sentido del agente iRNA descrito puede incluir una secuencia idéntica o sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias dianas de VEGF, por ejemplo sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias sentido proporcionadas en la Tabla 1, SEC ID NOs:2-401. La secuencia antisentido del agente iRNA puede incluir una secuencia complementaria a o sustancialmente complementaria a cualquiera de las secuencias dianas, por ejemplo complementaria a cualquiera de SEC ID NOs:2-401. Por “sustancialmente idéntica” se quiere decir que el desemparejamiento entre las secuencias nucleotídicas es menor que 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, o 1%. Preferiblemente, no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos difieren entre la secuencia diana y la secuencia sentido. Además, las secuencias que son “complementarias” entre sí (por ejemplo, secuencias sentido y antisentido) pueden ser completamente complementarias, o pueden tener no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos que carecen de complementariedad total.

Los pares sentido y antisentido de las secuencias de un agente iRNA pueden incluir uno cualquiera de los agentes proporcionados en la Tabla 2, o una secuencia que difiere en la hebra sentido de la secuencia citada en no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos, y en la hebra antisentido en no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos, o en ambas hebras en no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos.

En una realización preferida, las secuencias sentido de un agente iRNA incluyen las secuencias SEC ID NO:608, o una secuencia que difiere de la secuencia citada en no más de 1, 2, o nucleótidos.

La secuencia antisentido del agente iRNA descrito puede incluir una secuencia totalmente complementaria o sustancialmente complementaria a cualquiera de las secuencias dianas de VEGF, por ejemplo complementaria o sustancialmente complementaria a cualquiera de SEC ID NOs:2-401.

La secuencia antisentido del agente iRNA descrito incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias antisentido proporcionadas en la Tabla 2, o una secuencia que difiere de la secuencia citada en no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos. Esta secuencia antisentido puede ser completamente complementaria a una secuencia sentido, o tiene no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos desemparejados con la secuencia sentido.

En una realización preferida, la secuencia antisentido de un agente iRNA incluye la secuencia SEC ID NO:609, o una secuencia que difiere de la secuencia citada en no más de 1, 2, o nucleótidos.

En otra realización, el agente iRNA está químicamente modificado. Por ejemplo, el agente iRNA puede incluir un resto no nucleotídico.... [Seguir leyendo]

1. Un agente iRNA aislado, que comprende una secuencia sentido y una secuencia antisentido, en el que las secuencias sentido y antisentido forman un dúplex de RNA, y en el que la secuencia antisentido comprende una secuencia nucleotídica suficientemente complementaria a una secuencia diana de alrededor de 19 a 23 nucleótidos de una secuencia nucleotídica de VEGF, y en el que dicha secuencia diana difiere en no más de 1, 2 ó 3 nucleótidos de la secuencia de SEC ID NO: 344.

2. El agente iRNA de la reivindicación 1, en el que la secuencia sentido comprende una secuencia que difiere en no más de 1, 2 ó 3 nucleótidos de la secuencia de SEC ID NO: 344.

3. El agente iRNA de la reivindicación 1, en el que la secuencia sentido comprende una secuencia que difiere en no más de 1, 2 ó 3 nucleótidos de la secuencia de SEC ID NO: 608.

4. El agente iRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia antisentido comprende una secuencia que difiere en no más de 1, 2 ó 3 nucleótidos de la secuencia de SEC ID NO: 609.

5. El agente iRNA de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia antisentido comprende la secuencia de SEC ID NO: 609, y dicha secuencia sentido comprende la secuencia de SEC ID NO: 608.

6. El agente iRNA de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia antisentido consiste en la secuencia de SEC ID NO: 609, y dicha secuencia sentido consiste en la secuencia de SEC ID NO: 608.

7. El agente iRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el agente iRNA comprende además un resto no nucleotídico, en el que dicho resto no nucleotídico se selecciona preferiblemente de naproxeno, colesterol, tio-colesterol, ácido colánico y ácido retinoico.

8. El iRNA de la reivindicación 7, en el que las secuencias sentido y antisentido se estabilizan frente a la degradación nucleolítica.

9. El agente iRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 7 y 8, que comprende además uno o dos salientes en 3’, en el que dicho saliente o salientes en 3’ comprenden de 1 a 6 nucleótidos.

10. El agente iRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además

(a) un fosforotioato en el primer enlace internucleotídico en el extremo 5’ de las secuencias antisentido y sentido; y/o

(b) un fosforotioato en el primer enlace internucleotídico en el extremo 3’ de las secuencias antisentido y sentido.

11. El agente iRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además un nucleótido modificado en 2’.

12. El agente iRNA de la reivindicación 11, en el que el nucleótido modificado en 2’ comprende una modificación seleccionada del grupo que consiste en: 2’-desoxi, 2’-desoxi-2’-fluoro, 2’-O-metilo, 2’-O-metoxietilo (2’-O-MOE) , 2’-Oaminopropilo (2’-O-AP) , 2’-O-dimetilaminoetilo (2’-O-DMAOE) , 2’-O-dimetilaminopropilo (2’-O-DMAP) , 2’-Odimetilaminoetiloxietilo (2’-O-DMAEOE) , y 2’-O-N-metilacetamido (2’-O-NMA) .

13. Un método in vitro para reducir la cantidad de RNA de VEGF en una célula de un sujeto, que comprende poner en contacto la célula con un agente iRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Un método para obtener un agente iRNA de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo el método la síntesis del agente iRNA, en el que las hebras sentido y antisentido comprenden al menos una modificación que estabiliza al agente iRNA contra la degradación nucleolítica.

15. Una composición farmacéutica que comprende un agente iRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Un método para inhibir la expresión de VEGF, que comprende administrar una cantidad eficaz de un agente iRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, con la condición de que se excluya cualquier método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

17. Un agente iRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso en el tratamiento de un ser humano diagnosticado por tener o que tiene riesgo de tener degeneración macular del adulto (AMD) .

18. Un agente iRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso en el tratamiento de tumor o cáncer metastásico.

AL-DUP-4094_120 min. 5’-GCACAU AGGAGAG AUGAGCU-3’

3’. GUCGLGUAUCCUCUCUACUCGAA-5’

RT [min] Hebra 3Exo/En do Sitio de escisión Fragmento Fosfato Masa cal. Masa exp. Observaciones

1, 17 sentido endo U6-A7 5’-GCACAU 3-Fosfato 1920, 2 1920, 0 * algunas masas sin identificar

10, 34 antisentido endo U8-C9 UACUCGAA-5’ Fosfato cíclico 2554, 5 2554, 0 pequeño después de 30 min cinética lenta

14, 61 sentido 3-exo del siguiente fragmento AGGAGAGAUGAGCU - 4571, 8 4572, 0

15, 85 sentido endo U6-A7 AGGAGAGAUGAGCU-3 ’ - 4878, 0 4878, 0

17, 32 antisentido endo U15-A16 UCCUCUCUACUCGAA-5’ Fosfato cíclico 4693, 8 4693, 0

19, 37 antisentido endo U15-A16 UCCUCUCUACUCGAA.5’ 3-Fosfato 4711, 8 4711, 0 no detectado después de 30 min

21, 45 sentido 3-exo n-1 5’-GCACAUAGGAGAGAUGAGCU - 6492, 0 6492, 5 pequeño después de 30 min

22, 16 sentido FLP 5’-GCACAUAGGAGAGAUGAGCU-3’ - 6798, 2 6797, 5 sólo pequeñas cantidades de as-FLP detectadas

22, 86 antisentido 3-exo n-2 CGUGUAUCCUCUCUACUCGAA-5’ Fosfato cíclico 6630, 9 6631, 0

23, 91 antisentido 3-exo n-2 CGUGUAUCCUCllCUACUCGAA-5’ 3-Fosfato 6648, 9 6648, 0 no detectado después de 30 min

24, 32 antisentido 3-exo n-1 UCGUGUAUCCUCUCUACUCGAA5’ 3-Fosfato 6955, 1 6954, 8

FIG. 12