Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen PCSK9 humano en una célula,

comprendiendo dicho ARNbc al menos dos secuencias que son complementarias entre sí y en el que una hebra sentido comprende una primera secuencia y una hebra antisentido comprende una segunda secuencia que comprende una región de complementariedad que es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica para PCSK9, y en el que dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud e inhibiendo dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho PCSK9, la expresión de dicho gen PCSK9, en el que:

(a) dicha primera secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1229 y dicha segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1230; o

(b) dicha primera secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1227 y dicha segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1228.

Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen PCSK9

5 Campo de la invención

Esta invención se refiere a ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) , y a su uso en la mediación de la interferencia por ARN para inhibir la expresión del gen PCSK9 y al uso del ARNbc para tratar procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución de CSK9, tal como hiperlipidemia.

Antecedentes de la invención

La proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) es un miembro de la familia de subtilisina serina proteasa. Las otras ocho subtilisina proteasas de mamíferos, PCSK1-PCSK8 (también denominadas PC1/3, PC2, furina, PC4, 15 PC5/6, PACE4, PC7 y S1P/SKI-1) son proproteína convertasas que procesan una amplia variedad de proteínas en la ruta secretora y desempeñan papeles en diversos procesos biológicos (Bergeron F. (2000) J. Mol. Endocrinol. 24, 1-22, Gensberg, K., (1998) Semin. Cell Dev. Biol. 9. 11-17, Seidah, N. G. (1999) Brain Res. 848, 45-62, Taylor, N. A., (2003) FASEB J 17, 1215-1227, y Zhou, A., (1999) J. Biol, Chem 274, 20745-20748) . Se ha propuesto que PCSK9 desempeña un papel en el metabolismo del colesterol. La expresión de ARNm de PCSK9 está regulada por disminución por el colesterol de la dieta con la que se alimentan ratones (Maxwell, K. N., (2003) J. Lipid Res. 44, 2109-2119) , regulado por incremento por estatinas en células HepG2 (Dubuc, G., (2004) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 1454-1459) y regulado por incremento en ratones transgénicos para la proteína de unión al elemento regulador de esterol (SREBP) (Horton, J. D., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12027-12032) , similar a las enzimas biosintéticas del colesterol y el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR) . Además, se ha

encontrado que mutaciones de cambio de sentido de PCSK9 están asociadas con una forma de hipercolesterolemia dominante autosómica (Hchola3) (Abifadel, M. et al, (2003) Nat, Genet. 34, 154-156, Timms, K. M., (2004) Hum, Genet: 114, 343-353, Leren, T. P. (2004) Clin. Genet, 65, 419-422) . PCSK9 también puede desempeñar un papel en la determinación de los niveles de colesterol de LDL en la población general porque se han asociado polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con los niveles de colesterol en una población japonesa (Shioji, K., (2004) J. Hum. Genet. 49, 109-114) .

Las hipercolesterolemias dominantes autosómicas (ADH) son enfermedades monogénicas en las que los pacientes presentan niveles de colesterol de LDL y total elevados, xantomas en tendones y aterosclerosis prematura (Rader,

D. J., (2003) J. Clin, Invest. 111, 1795-1803) . La patogénesis de las ADH y una forma recesiva, hipercolesterolemia

recesiva autosómica (ARH) (Cohen, J. C., (2003) Curr. Opin. Lipidol. 14; 121-127) , se debe a defectos en la captación de LDL por el hígado. La ADH puede estar provocada por mutaciones de LDLR, que impiden la captación de LDL, o por mutaciones en la proteína en LDL, apolipoproteína B, que se une al LDLR. La ARH está provocada por mutaciones en la proteína de ARH que son necesarias para la endocitosis del complejo LDLR-LDL mediante su interacción con clatrina. Por tanto, si mutaciones de PCSK9 son agentes causantes en familias con Hchola3, parece probable que PCSK9 desempeñe un papel en la captación de LDL mediada por receptores.

Estudios de sobreexpresión apuntan a un papel de PCSK9 en el control de los niveles de LDLR y, por tanto, la captación de LDL por el hígado (Maxwell, K. N. (2004) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem, 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J, Biol. Chem. 279, 50630-50638) . La

45 sobreexpresión mediada por adenovirus de PCSK9 humano o de ratón durante 3 ó 4 días en ratones da como resultado niveles de colesterol de LDL y total elevados; este efecto no se observa en animales deficientes en LDLR (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 48863-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638) . Además, la sobreexpresión de PCSK9 da como resultado una grave reducción en proteína de LDLR hepática, sin afectar a los niveles de ARNm de LDLR, los niveles de proteína SREBP o la razón de proteína SREBP nuclear con respecto a citoplasmática. Estos resultados indican que PCSK9, o bien directa o bien indirectamente, reduce los niveles de proteína de LDLR mediante un mecanismo postranscripcional.

Se han diseñado mutaciones de pérdida de función en PCSK9 en modelos de ratón (Rashid et al., (2005) PNAS,

55 102, 5374-5379) , y se han identificado en individuos humanos (Cohen et al., (2005) , Nature Genetics., 37, 161-165) . En ambos casos, la pérdida de la función de PCSK9 conduce a una disminución del colesterol de LDLc y total. En un estudio de desenlace retrospectivo a lo largo de 15 años, se mostró que la pérdida de una copia de PCSK9 disminuía LDLc y conducía a una protección con riesgo-beneficio aumentada frente al desarrollo de cardiopatía cardiovascular (Cohen et al., 2006 N. Engl. J. Med., 354., 1264-1372) . Claramente, las pruebas hasta la fecha indican que la disminución de los niveles de PCSK9 disminuirá LDLc.

Recientemente, se ha mostrado que moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) bloquean la expresión génica en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia por ARN (iARN) . El documento WO 99/32619 (Fire et al.) describe el uso de ARNbc de al menos 25 nucleótidos de longitud para inhibir la expresión de 65 genes en C. elegans. Se ha mostrado también que ARNbc degrada ARN diana en otros organismos, incluyendo plantas (véase, por ejemplo, el documento WO 99/53050, Waterhouse et al., y el documento WO 99/61631, Heifetz

et al.) , Drosophila (véase, por ejemplo, Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200) y mamíferos (véase el documento WO 00/44895, Limmer; y el documento DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.) . Este mecanismo natural se ha convertido en el centro del desarrollo de una nueva clase de agentes farmacéuticos para tratar trastornos que están provocados por la regulación aberrante o no deseada de un gen.

A pesar de avances significativos en el campo de iARN y avances en el tratamiento de procesos patológicos que pueden estar mediados por la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, sigue habiendo una necesidad de agentes que puedan inhibir la expresión del gen PCSK9 y que puedan tratar enfermedades asociadas con la expresión del gen PCSK9 tales como hiperlipidemia.

Sumario de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones.

La invención proporciona una solución al problema de tratar enfermedades que pueden modularse mediante la regulación por disminución de la proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) usando ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para silenciar la expresión de PCSK9.

La invención proporciona ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) tal como se define en las reivindicaciones, así como composiciones y métodos in vitro para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula usando tal ARNbc. La invención también proporciona tal ARNbc para su uso en el tratamiento de estados patológicos que pueden modularse mediante la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, tales como hiperlipidemia. El ARNbc de la invención comprende una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región que tiene menos de nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud, y es sustancialmente complementaria a al

menos parte de un transcrito de ARNm del gen PCSK9.

En una realización, la invención proporciona moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión del gen PCSK9. El ARNbc comprende al menos dos secuencias que son complementarias entre sí. El ARNbc comprende una hebra sentido que comprende una primera secuencia y una hebra antisentido que comprende una segunda secuencia. La hebra antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente complementaria a al menos parte de un ARNm que codifica para PCSK9, y la región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud. El ARNbc, tras hacer que contacte con una célula que expresa la PCSK9, inhibe la expresión del gen PCSK9 en al menos el 40%.

Según la invención, la primera secuencia... [Seguir leyendo]

1. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen PCSK9 humano en una célula, comprendiendo dicho ARNbc al menos dos secuencias que son complementarias entre sí y en el que una hebra sentido comprende una primera secuencia y una hebra antisentido comprende una segunda secuencia que comprende una región de complementariedad que es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica para PCSK9, y en el que dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud e inhibiendo dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho PCSK9, la expresión de dicho gen PCSK9, en el que:

(a) dicha primera secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1229 y dicha segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1230; o

(b) dicha primera secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1227 y dicha segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 1228.

2. ARNbc según la reivindicación 1, comprendiendo dicho ARNbc al menos un nucleótido modificado.

3. ARNbc según la reivindicación 2, en el que dicho nucleótido modificado se elige del grupo de un nucleótido modificado con 2’-O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5’-fosforotioato, un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico, un nucleótido modificado con 2’-desoxi-2’flúor, un nucleótido modificado con 2’-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, nucleótido modificado con 2’-amino, nucleótido modificado con 2’-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.

4. Composición farmacéutica para inhibir la expresión del gen PCSK9 en un organismo, que comprende un ARNbc y un portador farmacéuticamente aceptable, en la que el ARNbc es según la reivindicación 1.

5. Método in vitro para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula, comprendiendo el método:

(a) introducir en la célula un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) , siendo el ARNbc tal como se define en la reivindicación 1; y

(b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del trascrito de ARNm del gen PCSK9, inhibiendo de ese modo la expresión del gen PCSK9 en la célula.

6. ARNbc para tratar, prevenir o gestionar procesos patológicos que pueden mediarse mediante la regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, siendo el ARNbc según la reivindicación 1.

7. Vector para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula, comprendiendo dicho vector una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos una hebra de un ARNbc, en el que dicho ARNbc es según la reivindicación 1.

8. Célula aislada que comprende el ARNbc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el vector según la reivindicación 7.

9. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para reducir el nivel de expresión de un gen PCSK9 humano en una célula, siendo dicho ARNbc según la reivindicación 1.

10. ARNbc según la reivindicación 9, en el que dicho contacto reduce el nivel de expresión de dicho gen PCSK9.

11. ARNbc según la reivindicación 9, en el que dicho contacto se realiza in vitro a 30 nM o menos.

12. Composición farmacéutica para reducir el nivel de expresión del gen PCSK9 en un organismo, que comprende el ARNbc según la reivindicación 9 y un portador farmacéuticamente aceptable.

13. ARNbc según la reivindicación 9, para tratar un trastorno asociado a PCSK9.

14. ARNbc según la reivindicación 13, en el que dicho trastorno asociado a PCSK9 es hiperlipidemia.