Bibliotecas de polipéptidos sintéticos y métodos para generar variantes polipeptídicas diversificadas de forma natural.

Un método para producir una colección de ácidos nucleicos, en el que cada ácido nucleico codifica un dominio variable de inmunoglobulina humana que comprende una pluralidad de secuencias de región determinante de complementariedad 3 (CDR3) aisladas por separado del repertorio de dominio variable de inmunoglobulina de una especie de mamífero o un mamífero no humano inmunizado,

comprendiendo el método:

(a) proporcionar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico de Marco conservado Aceptor que codifican dominios variables de inmunoglobulina humana distintos, comprendiendo cada secuencia de ácido nucleico de Marco conservado Aceptor una primera región marco conservada (FR1), una segunda región marco conservada (FR2), una tercera región marco conservada (FR3) y una cuarta región marco conservada (FR4), en las que las regiones FR1 y FR2 están intercaladas con una región determinante de complementariedad 1 (CDR1), las regiones FR2 y FR3 están intercaladas con una región determinante de complementariedad 2 (CDR2), y las regiones FR3 y FR4 están intercaladas con una secuencia de ácido nucleico de relleno que comprende al menos dos sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo IIs intercalados con una secuencia de ácido nucleico aleatoria que codifica un polipéptido que realiza la función de una región CDR3 de inmunoglobulina variable;

(b) proporcionar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico diversificadas que codifican secuencias de región determinante de complementariedad 3 (CDR3) del repertorio de inmunoglobulina de especie de mamífero o el mamífero no humano inmunizado en el que cada una de la pluralidad de secuencias de ácido nucleico diversificadas comprende un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo IIs en cada extremo;

(c) digerir cada una de la pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones CDR3 usando una enzima de restricción de Tipo IIs que se une con el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo IIs de la etapa (b) y digerir la secuencia de ácido nucleico de relleno de la etapa (a) del Marco conservado Aceptor usando una enzima de restricción de Tipo IIs que se une con el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo IIs de la etapa (a); y

(d) ligar las secuencias de ácido nucleico digeridas que codifican las regiones CDR3 o las secuencias de aminoácidos de la etapa (c) en el Marco conservado Aceptor digerido de la etapa (c) de modo que las regiones FR3 y FR4 estén intercaladas con las secuencias de ácido nucleico que codifican la región CDR3 o la secuencia de aminoácidos que puede cumplir el papel de una región CDR3 y se restauran secuencias que codifican un dominio variable de inmunoglobulina completo que no contienen los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo IIs de las etapas (a) y (b).

Bibliotecas de polipéptidos sintéticos y métodos para generar variantes polipeptídicas diversificadas de forma natural Campo de ¡a invención

La invención se refiere a la generación de bibliotecas de secuencias de ADN que codifican polipéptidos homólogos y al uso de dichas bibliotecas. La presente invención se refiere en particular a la generación de colecciones de fragmentos de anticuerpos sintéticos en las que una o varias reacciones determinantes de complementariedad (CDR) se reemplazan por una colección de las CDR correspondientes capturadas a partir de una fuente natural. La invención se refiere además a la generación de colecciones de fragmentos de anticuerpo que contienen CDR derivadas de un animal inmunizado y su uso como una mejor fuente para derivar fragmentos de anticuerpo de alta afinidad. La invención se refiere además a la dosificación de una parte de un polipéptido insertando una secuencia diversificada de origen sintético o natural sin la necesidad de modificación de la secuencia codificante del polipéptido original.

Antecedentes de )a invención

Un anticuerpo está compuesto de cuatro polipéptidos: dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. La parte de unión a antígeno de un anticuerpo está formada por el dominio variable de cadena ligera (VL) y el dominio variable de cadena pesada (VH). En un extremo de estos dominios seis bucles forman el sitio de unión al antígeno y también se denominan las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Tres CDR se localizan en el dominio VH (H1, H2 y H3) y las otras tres están en el dominio VL (L1, L2 y L3). Durante el desarrollo de linfocitos B se forma una región de ¡nmunoglobulina única por recombinación somática conocida como recombinación V(D)J. La región variable de la cadena pesada o ligera de ¡nmunoglobulina está codificada por diferentes segmentos génicos. La cadena pesada está codificada por tres segmentos denominados segmentos variables (V), de diversidad (D) y de unión (J) mientras que la cadena ligera variable está formada por la recombinación de solamente dos segmentos V y J. Un gran número de parátopos de anticuerpos pueden generarse por recombinación entre una de las múltiples copias de los segmentos V, D y J que están presentes en el genoma. El segmento V codifica la CDR1 y CDR2 mientras que la CDR3 se genera por los acontecimientos de recombinación. Durante el transcurso de la respuesta ¡nmunitaria se introduce más diversidad en el sitio de unión a antígeno por un proceso denominado hipermutación somática (SHM). Durante este proceso se introducen mutaciones puntuales en los genes variables de las cadenas pesadas y ligeras y en particular en las regiones que codifican las CDR. Esta variabilidad adicional permite la selección y expansión de linfocitos B que expresan variantes de anticuerpo con afinidad mejorada por su antígeno afín.

En años recientes han surgido varias tecnologías de presentación y estas permiten la exploración de grandes colecciones de proteínas o péptidos. Estas incluyen presentación en fagos, presentación bacteriana, presentación en levadura y presentación en ribosomas (Smith GP. Science. 14 Jun 1985; 228(4705): 1315-7; Hanes J y Plückthun A. Proc Nati Acad Sci USA. 13 May 1997; 94(10): 4937-42.; Daugherty PS efa/., Protein Eng. Sep 1998; 11(9): 825- 32.; Boder ET y Wittrup KD. Nat Biotechnol. Jun 1997; 15(6):553-7). En particular estos métodos se han aplicado extensivamente a anticuerpos y fragmentos de los mismos. Se han descrito varios métodos para generar bibliotecas de polipéptidos y para explorar con respecto a miembros con propiedades de unión deseadas.

Un primer enfoque es capturar por amplificación gènica genes de ¡nmunoglobulina reordenados de repertorios naturales usando tejidos o células de seres humanos u otros mamíferos como una fuente de diversidad genética. Estas colecciones de cadenas pesadas y ligeras reordenadas (VH y VL) se combinan después para generar bibliotecas de pares de unión que pueden presentarse en bacteriófagos o en otros paquetes de presentación tales como bacterias, células de levadura o de mamífero. En este caso se captura una fracción grande del repertorio de ¡nmunoglobulina hallado en el donante. Por lo tanto todos los marcos conservados codificados por los genes de línea germinal del donante pueden encontrarse en dichos repertorios así como diversidad generada tanto por recombinación de V(D)J como por hipermutación somática (Marks JD efa/., J Mol Biol. 5 Die 1991; 222(3): 581-97; Patente de Estados Unidos N- 5.969.108 de McCaffety).

Una limitación de los repertorios naturales es que los anticuerpos de origen natural pueden basarse en marcos conservados con baja estabilidad intrínseca que limitan sus niveles de expresión, periodo de validez y su utilidad como reactivos o moléculas terapéuticas. Para superar estas limitaciones se han desarrollado varios métodos para generar bibliotecas de anticuerpos sintéticos. En estos enfoques, se seleccionan un único o un número limitado de marcos conservados de anticuerpos seleccionados codificados por sus genes de línea germinal correspondientes. La selección de estos marcos conservados se basa habitualmente en su estabilidad bioquímica y/o su frecuencia de expresión en repertorios de anticuerpos naturales. Para generar una colección de proteínas de unión, se introduce después diversidad sintética en todas o subconjunto de CDR. Típicamente se diversifica bien el total de o parte de las CDR usando diferentes estrategias. En algunos casos se introdujo diversidad en posiciones seleccionadas dentro de las CDR (Knappik A et a/., J Mol Biol. 11 Feb 2000; 296(1): 57-86). Los restos diana pueden ser los implicados frecuentemente en el contacto con antígenos, los que presentan diversidad máxima en repertorios de anticuerpos naturales o incluso restos que serían preferentemente dianas de la maquinaria celular implicada en la

generación de hipermutaciones somáticas durante el proceso de maduración de afinidad natural (Balint RF, Larrick JW. Gene. 27 Dic 1993; 137(1): 109-18.).

Se han usado varios métodos para diversificar los CDR de anticuerpos. Se ha usado extensivamente PCR solapante usando oligonucleótidos degradados para ensamblar elementos de marco conservado y CDR para reconstituir genes de anticuerpo. En otro enfoque, se han generado sitios de enzimas de restricción únicos en las regiones marco conservadas en el límite de cada CDR permitiendo la introducción de CDR diversificadas por clonación mediada por enzimas de restricción. En cualquier caso, como todos los miembros de la biblioteca se basan en marcos conservados con características seleccionadas y preferidas, se anticipa que los anticuerpos derivados de estos repertorios son más estables y proporcionan una mejor fuente de reactivos útiles (Knappik, documento US 6696248; Sidhu SS, ef a/., Methods Enzymol. 2000; 328: 333-63; Lee CV ef a/., J Mol Biol. 23 Jul 2004; 340(5): 1073-93).

Soderlind ef a/ (Nature Biotechnology 18(8): p 852-856) desvela un método para producir una colección de ácidos nucleicos en la que dicha secuencia de ácido nucleico contiene secuencias de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 ensambladas aleatoriamente de regiones variables de cadena pesada o ligera.

Sidhu ef a/(J Mol Biol 338(2): p 299-310) desvela un método para producir una colección de ácidos nucleicos en la que cada ácido nucleico codifica un dominio variable de inmunoglobulina que comprende una pluralidad de secuencias de CDR, en el que se introduce diversidad con diversidad sintética y mutagénesis dirigida.

El documento WO 2008/112640 desvela un método para producir una colección de ácidos nucleicos en el que cada ácido nucleico codifica un dominio variable de inmunoglobulina que comprende una pluralidad de secuencias de CDR, en el que se introduce diversidad con diversidad sintética y mutagénesis dirigida.

Sin embargo, una limitación importante de estas bibliotecas sintéticas es que una proporción significativa de los miembros de bibliotecas nos se expresan porque las secuencias diversificadas aleatoriamente no permiten una expresión y/o un plegamiento apropiados de la proteína. Este problema es particularmente significativo para la CDR3 de la cadena pesada. De hecho, esta CDR contribuye con frecuencia a la mayoría de la energía de unión para el antígeno y es altamente diversa en longitud y secuencia. Aunque la otra CDR (H1, H2, L1, L2 y L3) puede adoptar solamente un número limitado de conformaciones tridimensionales, conocidas como pliegues canónicos, el número de conformaciones que pueden adoptarse por la CDR3 de cadena pesada sigue siendo demasiado diverso para predecir (Al-Lazikani B ef a/., J Mol Biol. 7 Nov 1997; 273(4): 927-48). Además, el uso de oligonucleótidos... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una colección de ácidos nucleicos, en el que cada ácido nucleico codifica un dominio variable de ¡nmunoglobulina humana que comprende una pluralidad de secuencias de región determinante de complementariedad 3 (CDR3) aisladas por separado del repertorio de dominio variable de ¡nmunoglobulina de una especie de mamífero o un mamífero no humano inmunizado, comprendiendo el método:

(a) proporcionar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico de Marco conservado Aceptor que codifican dominios variables de ¡nmunoglobulina humana distintos, comprendiendo cada secuencia de ácido nucleico de Marco conservado Aceptor una primera región marco conservada (FR1), una segunda región marco conservada (FR2), una tercera región marco conservada (FR3) y una cuarta región marco conservada (FR4), en las que las regiones FR1 y FR2 están intercaladas con una región determinante de complementariedad 1 (CDR1), las regiones FR2 y FR3 están intercaladas con una región determinante de complementariedad 2 (CDR2), y las regiones FR3 y FR4 están intercaladas con una secuencia de ácido nucleico de relleno que comprende al menos dos sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo lis intercalados con una secuencia de ácido nucleico aleatoria que codifica un polipéptido que realiza la función de una región CDR3 de ¡nmunoglobulina variable;

(b) proporcionar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico diversificadas que codifican secuencias de región determinante de complementariedad 3 (CDR3) del repertorio de ¡nmunoglobulina de especie de mamífero o el mamífero no humano inmunizado en el que cada una de la pluralidad de secuencias de ácido nucleico diversificadas comprende un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo lis en cada extremo;

(c) digerir cada una de la pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones CDR3 usando una enzima de restricción de Tipo lis que se une con el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo lis de la etapa (b) y digerir la secuencia de ácido nucleico de relleno de la etapa (a) del Marco conservado Aceptor usando una enzima de restricción de Tipo lis que se une con el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo lis de la etapa (a); y

(d) ligar las secuencias de ácido nucleico digeridas que codifican las regiones CDR3 o las secuencias de aminoácidos de la etapa (c) en el Marco conservado Aceptor digerido de la etapa (c) de modo que las regiones FR3 y FR4 estén intercaladas con las secuencias de ácido nucleico que codifican la región CDR3 o la secuencia de aminoácidos que puede cumplir el papel de una región CDR3 y se restauran secuencias que codifican un dominio variable de ¡nmunoglobulina completo que no contienen los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo lis de las etapas (a) y (b).

2. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) se realiza amplificando la secuencia de CDR3 de una especie de mamífero o el mamífero no humano inmunizado usando cebadores oligonucleotídicos que contienen un sitio de restricción de Tipo lis.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el cebador oligonucleotídico se diseña para potenciar la compatibilidad entre la secuencia de CDR3 de mamífero y el Marco conservado Aceptor que codifica un dominio variable de ¡nmunoglobulina humana.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el cebador oligonucleotídico se diseña para modificar una secuencia de ácido nucleico en un extremo de la secuencia de CDR3 de mamífero para producir una secuencia de nucleótidos cohesiva compatible en el Marco conservado Aceptor que codifica un dominio variable de ¡nmunoglobulina humana.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la especie de mamífero es ser humano, primate no humano, roedor, canino, felino, oveja, cabra, vaca, caballo, un miembro de la familia Camelidae, llama, camello, dromedario o cerdo; o en el que el mamífero no humano es primate no humano, roedor, canino, felino, oveja, cabra, vaca, caballo, llama, camello, dromedario o cerdo.

6. El método de la reivindicación 1, en el que los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo lis de la etapa (a) y la etapa (b) se reconocen por una enzima de restricción de Tipo lis diferente, preferentemente en el que los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo lis son sitios de reconocimiento de BsmBI, sitios de reconocimiento de Bsal, sitios de reconocimiento de Fokl o una combinación de los mismos.

7. El método de la reivindicación 1, en el que las secuencias de ácido nucleico diversificadas que codifican secuencias de CDR3 codifican secuencias de CDR3 de cadena pesada (CDR FI3), secuencias de CDR3 de cadena ligera (CDR L3) o una combinación de las mismas.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico de Marco conservado Aceptor comprende una secuencia de gen variable de cadena pesada humana seleccionada de VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 y VH5-51.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico de Marco conservado Aceptor comprende una secuencia de gen variable de cadena ligera kappa humana, preferentemente en el que la secuencia de gen variable de cadena ligera kappa humana se selecciona de VK1 -33, VK1 -39, VK3-11, VK3-15 y VK3-20.

10. El método de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico de Marco conservado Aceptor comprende una secuencia de gen variable de cadena ligera lambda humana, preferentemente en el que la secuencia de gen variable de cadena ligera lambda humana se selecciona de VL1 -44 y VL1 -51.

5 11. El método de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de secuencias de ácido nucleico de Marco conservado

Aceptor comprende una mezcla de al menos una secuencia de ácido nucleico de Marco conservado Aceptor de cadena pesada variable (VH) y al menos una secuencia de ácido nucleico de Marco conservado Aceptor de cadena ligera variable.

10 12. El método de la reivindicación 1, que comprende además las etapas de (e) clonar la biblioteca de ácidos

nucleicos que codifican dominios variables de inmunoglobulina de la etapa (d) en un vector de expresión y (f) transformar el vector de expresión de la etapa (e) en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora en condiciones suficientes para expresar una pluralidad de dominios variables de inmunoglobulina codificados por la biblioteca.

13. El método de la reivindicación 12, en el que la célula hospedadora es & co/<.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el vector de expresión es un fagémido o un vector de fago.

20 15. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) se realiza amplificando la secuencia de CDR H3 del

mamífero no humano usando cebadores oligonucleotídicos que contienen un sitio de restricción lis de Fokl.