Bancos de polipéptidos sintéticos y métodos para generar variantes de polipéptidos diversificados de forma natural.

Un método para producir una colección de ácidos nucleicos, donde cada ácido nucleico codifica un dominio variable de la inmunoglobulina humana que comprende una pluralidad de secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) aisladas separadamente del repertorio del dominio variable de la inmunoglobulina de una especie de mamífero,

aislado separadamente del repertorio del dominio variable de la inmunoglobulina de un ser humano, aislado separadamente del repertorio del dominio variable de la inmunoglobulina de una especie de mamífero no humano, o aislado separadamente de los dominios variables de la inmunoglobulina de un mamífero no humano humanizado, el método que comprende:

(a) proporcionar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos de la estructura aceptora que codifican dominios variables de inmunoglobulina humana distintos, cada secuencia de ácidos nucleicos de la estructura aceptora que comprende una primera región estructural (FR1), una segunda región estructural (FR2), una tercera región estructural (FR3), y una cuarta región estructural (FR4), donde las regiones FR1 y FR2 están intercaladas en una región determinante de complementariedad 1 (CDR1), las regiones FR2 y FR3 están intercaladas en una región determinante de complementariedad 2 (CDR2), y las regiones FR3 y FR4 están intercaladas en una secuencia de ácidos nucleicos de relleno que comprende al menos dos sitios de reconocimiento de la enzimas de restricción Tipo IIs intercalados en una secuencia de ácidos nucleicos aleatoria;

(b) proporcionar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diversificadas que codifican las secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) aisladas del repertorio de inmunoglobulina de la especie de mamífero donde cada una de la pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diversificadas comprende un sitio de reconocimiento de las enzimas de restricción Tipo IIs en cada extremidad;

(c) digerir cada una de la pluralidad de las secuencias de ácidos nucleicos que codifica las regiones CDR3 usando una enzima de restricción Tipo II que se une al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Tipo IIs de la etapa (b) y digerir la secuencia de ácidos nucleicos de relleno de la etapa (a) de la estructura aceptora usando una enzima de restricción Tipo II que se une al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Tipo IIs de la etapa (a); y

(d) ligar las secuencias de ácidos nucleicos digeridas que codifican las regiones de CDR3 o las secuencias de aminoácidos de la etapa (c) en la estructura aceptora digerida de la etapa (c) de modo que las regiones FR3 y FR4 se intercalan en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la región CDR3 o la secuencia de aminoácidos que puede cumplir el papel de una región CDR3 y se restauran secuencias que codifican el dominio variable de la inmunoglobulina completa que no contienen los sitios de reconocimiento de la enzimas de restricción Tipo IIs de las etapas (a) y (b).

Bancos de polipéptidos sintéticos y métodos para generar variantes de polipéptidos diversificados de forma natural

Campo de la invención La invención se refiere a la generación de bancos de secuencias de ADN que codifican polipéptidos homólogos y al uso de tales bancos. Esta invención en particular se refiere a la generación de colecciones de fragmentos del anticuerpo sintético en se reemplazan una o varias regiones determinantes de complementariedad (CDR) por una colección de la CDR correspondiente capturada de una fuente natural. La invención además se refiere a la generación de colecciones de fragmentos del anticuerpo que contienen CDR derivada de un animal inmunizado y su uso como una fuente mejor para derivar fragmentos del anticuerpo de alta afinidad. La invención además se refiere a la diversificación de una porción de un polipéptido mediante la inserción de una secuencia diversificada de origen sintético o natural sin la necesidad de modificación de la original secuencia codificadora del polipéptido.

Antecedentes de la invención Un anticuerpo se compone de cuatro polipéptidos: dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas. La porción de unión al antígeno de un anticuerpo está formada por el dominio variable de la cadena liviana (VL) y el dominio variable de cadena la pesada (VH) . En una extremidad de estos dominios seis bucles forman el sitio de unión al antígeno y también se denominan como regiones determinantes de complementariedad (CDR) . Tres CDRs se encuentran en el dominio VH (H1, H2 y H3) y las otras tres están en el dominio VL (L1, L2 y L3) . Durante el desarrollo de células B una región única de la inmunoglobulina se forma por recombinación somática conocida como recombinación V (D) .1. La región variable de la cadena pesada o liviana de la inmunoglobulina está codificada por diferentes segmentos del gen. La cadena pesada está codificada por tres segmentos llamados segmentos variable (V) , de diversidad (D) y unión (J) , mientras que la variable de cadena liviana está formada por la recombinación de solo dos segmentos V y J. Un gran número de paratopes de anticuerpo se puede generar por la recombinación entre una de las múltiples copias de los segmentos V, D y J que están presentes en el genoma. El segmento V codifica la CDR1 y CDR2 mientras que la CDR3 es generada por los eventos de recombinación. Durante el curso de la respuesta inmune se introduce diversidad adicional en el sitio de unión del antígeno por un proceso llamado hipermutación somática (SHM) . Durante este proceso se introducen mutaciones puntuales en los genes variables de las cadenas pesada y liviana y en particular en las regiones que codifican las CDRs. Esta variabilidad adicional permite la selección y expansión de las células B que expresan variantes de anticuerpos con una mayor afinidad por su antígeno cognado.

En los últimos años han surgido varias tecnologías de visualización que permiten analizar grandes colecciones de proteínas o péptidos. Estas incluyen despliegue en fagos, despliegue en bacterias, despliegue en levadura y despliegue en ribosomas (Smith GP. Science. 1985 Jun 14;228 (4705) :1315-7; Hanes J y Pliickthun A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 May 13;94 (10) :4937-42; Daugherty PS et al., Protein Eng. 1998 Sep; 11 (9) :825-32.; Boder ET y Wittrup 1 (13. Nat Biotechnol. 1997 Jun; 15 (6) :553-7) . En particular, estos métodos se han aplicado ampliamente para anticuerpos y fragmentos de los mismos. Se han descripto numerosos métodos para generar bancos de polipéptidos y seleccionar miembros con propiedades de unión deseadas.

Un primer enfoque es capturar por amplificación génica los genes de inmunoglobulina reordenados a partir de repertorios naturales, usando tejidos o células de seres humanos u otros mamíferos como fuente de diversidad genética. Estas colecciones de cadenas liviana y pesadas (VH y VL) reordenadas se combinan para generar bancos de pares de unión que se pueden desplegar en el bacteriófago o en otros paquetes de despliegue, tales como células de bacterias, levaduras o mamífero. En este caso se captura una gran fracción del repertorio de inmunoglobulina que se encuentra en el donante. Por lo tanto todas las estructuras codificadas por los genes de la línea germinal donante se pueden encontrar en tales repertorios, así como la diversidad generada por la recombinación de V (D) J y por hipermutación somática (Marks JD et al, J Mol Biol 05 de diciembre 1991;. 222 (3) : 581-97; McCaffety patente de US Nº 5.969.108) .

Una limitación de los repertorios naturales es que los anticuerpos naturales se pueden basar en estructuras con baja estabilidad intrínseca que limitan sus niveles de expresión, vida media y su utilidad como reactivos o moléculas terapéuticas. Con el fin de superar estas limitaciones han sido desarrollados numerosos métodos para generar bancos de anticuerpos sintéticos. En estos enfoques, se seleccionan un número único o limitado de estructuras de anticuerpo seleccionadas codificadas por sus correspondientes genes de la línea germinal. La selección de estas estructuras se basa comúnmente en su estabilidad bioquímica y/o su frecuencia de expresión en repertorios de anticuerpos naturales. Con el fin de generar una colección de proteínas de unión, luego se introduce diversidad sintética en todos o un subconjunto de CDRs. Típicamente, la totalidad o parte de la CDR se diversifica usando diferentes estrategias. En algunos casos la diversidad se introdujo en posiciones seleccionadas dentro de las CDR (Knappik A et a1, J Mol Biol 11 de febrero 2000; 296 (1) :57-86) . Los residuos selectivos pueden ser los que están frecuentemente involucrados en el contacto con el antígeno, los que presentan máxima diversidad en los repertorios de anticuerpos naturales o incluso los residuos que dirigidos preferentemente por la maquinaria celular implicada en

la generación de hipermutaciones somáticas durante el proceso de maduración de afinidad natural (Balint RF, Larrick JW. Gene. 1993 Dec 27;137 (1) :109-18.) .

Varios métodos se han usado para diversificar las CDR de los anticuerpos. La PCR por superposición que usa oligonucleótidos degenerados se ha utilizado ampliamente para ensamblar los elementos de la estructura y las CDR para reconstituir los genes de anticuerpos. En otro enfoque, se han manipulado genéticamente sitios de enzimas de restricción únicos en las regiones de marco en el límite de cada CDR para permitir la introducción de CDRs diversificadas por clonación mediada por la enzima de restricción. En cualquier caso, como todos los miembros de la biblioteca se basan en estructuras con características seleccionadas y preferidas, se prevé que los anticuerpos derivados de estos repertorios sean más estables y proporcionen una mejor fuente de reactivos útiles. (Knappik, US 6.696.248; Sidhu SS, et al, Methods Enzymol 2000; 328:333-63; Lee CV et al, J Mol Biol 2004 23 de julio; 340 (5) : 1073-1093) .

Sin embargo, una limitación importante de estos bancos sintéticos es que una proporción significativa de los miembros de la biblioteca no se expresa porque las secuencias diversificadas en forma aleatoria no permiten la expresión y/o plegamiento de adecuados de la proteína. Este problema es particularmente significativo para la CDR3 de la cadena pesada. En efecto, esta CDR a menudo contribuye la mayor parte de la energía de unión al antígeno y es altamente diversa en longitud y secuencia. Si bien las otras CDR (H1, H2, Ll, L2 y L3) solo pueden adoptar un número limitado de conformaciones tridimensionales, conocidas como pliegues canónicos, el número de conformaciones que pueden ser adoptadas por la cadena pesada CDR3 aún es demasiado amplio para ser predicho (Al-Lazikani B et al., J Mol Biol. 1997 Nov 7; 273 (4) :927-48) . Además, el uso de oligonucleótidos degenerados largos utilizado para cubrir CDR H3 largos a menudo introduce supresiones de pares de bases individuales. Estos factores reducen significativamente el tamaño funcional de los repertorios sintéticos.

Los repertorios naturales y sintéticos tienen ventajas y limitaciones. Por un lado, las estrategias que dependen de la captura de genes variables del anticuerpo reordenado naturalmente, no son óptimas, ya que incluyen estructuras potencialmente menos favorables dentro de la biblioteca. Un aspecto positivo es que estos genes variables reordenados incluyen CDRs que son compatibles con el plegado de dominio apropiado, ya que se han expresado en el contexto de un anticuerpo natural. Por otro lado, las estrategias basadas en la selección de estructuras y la inserción de diversidad sintética se benefician de la mejor estabilidad de las estructuras, pero están limitadas por el gran número de secuencias de CDR que no son compatibles con el plegado... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Un método para producir una colección de ácidos nucleicos, donde cada ácido nucleico codifica un dominio variable de la inmunoglobulina humana que comprende una pluralidad de secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) aisladas separadamente del repertorio del dominio variable de la inmunoglobulina de una especie de mamífero, aislado separadamente del repertorio del dominio variable de la inmunoglobulina de un ser humano, aislado separadamente del repertorio del dominio variable de la inmunoglobulina de una especie de mamífero no humano, o aislado separadamente de los dominios variables de la inmunoglobulina de un mamífero no humano humanizado, el método que comprende:

(a) proporcionar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos de la estructura aceptora que codifican dominios variables de inmunoglobulina humana distintos, cada secuencia de ácidos nucleicos de la estructura aceptora que comprende una primera región estructural (FR1) , una segunda región estructural (FR2) , una tercera región estructural (FR3) , y una cuarta región estructural (FR4) , donde las regiones FR1 y FR2 están intercaladas en una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) , las regiones FR2 y FR3 están intercaladas en una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) , y las regiones FR3 y FR4 están intercaladas en una secuencia de ácidos nucleicos de relleno que comprende al menos dos sitios de reconocimiento de la enzimas de restricción Tipo IIs intercalados en una secuencia de ácidos nucleicos aleatoria;

(b) proporcionar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diversificadas que codifican las secuencias de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) aisladas del repertorio de inmunoglobulina de la especie de mamífero donde cada una de la pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diversificadas comprende un sitio de reconocimiento de las enzimas de restricción Tipo IIs en cada extremidad;

(c) digerir cada una de la pluralidad de las secuencias de ácidos nucleicos que codifica las regiones CDR3 usando una enzima de restricción Tipo II que se une al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Tipo IIs de la etapa (b) y digerir la secuencia de ácidos nucleicos de relleno de la etapa (a) de la estructura aceptora usando una enzima de restricción Tipo II que se une al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Tipo IIs de la etapa (a) ; y

(d) ligar las secuencias de ácidos nucleicos digeridas que codifican las regiones de CDR3 o las secuencias de aminoácidos de la etapa (c) en la estructura aceptora digerida de la etapa (c) de modo que las regiones FR3 y FR4 se intercalan en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la región CDR3 o la secuencia de aminoácidos que puede cumplir el papel de una región CDR3 y se restauran secuencias que codifican el dominio variable de la inmunoglobulina completa que no contienen los sitios de reconocimiento de la enzimas de restricción Tipo IIs de las etapas (a) y (b) .

2. El método de la reivindicación 1, donde la etapa (b) se realiza mediante amplificación de la secuencia CDR3 de una especie de mamífero usando cebadores de oligonucleótidos que contienen un sitio de restricción Tipo IIs, donde la etapa (b) se realiza mediante la amplificación de la secuencia CDR3 de una especie de mamífero no humano usando cebadores de oligonucleótidos que contienen un sitio de restricción FokI IIs, o donde la etapa (b) se realiza mediante la amplificación de la secuencia CDR3 del mamífero no humano inmunizado usando cebadores de oligonucleótidos que contienen un sitio de restricción Tipo IIs.

El método de la reivindicación 2, donde el cebador de oligonucleótido se diseña para aumentar la compatibilidad entre la secuencia de CDR3 de mamífero y la estructura aceptora que codifica un dominio variable de la inmunoglobulina humana.

4. El método de la reivindicación 3, donde el cebador de oligonucleótido se diseña para modificar una secuencia de ácidos nucleicos en un límite de la secuencia de CDR3 de mamífero para producir una compatible secuencia de nucleótidos cohesiva en la estructura aceptora que codifica un dominio variable de la inmunoglobulina humana.

5. El método de la reivindicación 1, donde la especie no humana es primates no humanos, roedores, caninos, felinos, ovejas, cabras, vacas, caballos, un miembro de la familia de los camélidos, llama, camello, dromedario, o cerdo.

6. El método de la reivindicación 1, donde los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción Tipo IIs de la etapa (a) y la etapa (b) son reconocidos por una enzima de restricción Tipo IIs diferente.

7. El método de la reivindicación 6, donde los sitios de reconocimiento de la enzimas de restricción Tipo IIs son sitios de reconocimiento BsmBI, sitios de reconocimiento BsaI, sitios de reconocimiento FokI o una combinación de estos.

8. El método de la reivindicación 1, donde las secuencias de ácidos nucleicos diversificadas que codifican las secuencias CDR3 codifican secuencias CDR3 de la cadena pesada (CDR H3) , o donde las secuencias de ácidos

nucleicos diversificadas que codifican las secuencias CDR3 codifican secuencias CDR3 (CDR L3) de cadena liviana.

9. El método de la reivindicación 1, donde la secuencia de ácidos nucleicos de la estructura aceptora comprende una secuencia del gen variable de la cadena pesada humana seleccionada de VH1-2, V1-11-69, VH118, VH3-30, VH3-48, VH3-23, y VH5-51.

10. El método de la reivindicación 1, donde la secuencia de ácidos nucleicos de la estructura aceptora comprende una secuencia del gen variable de la cadena liviana kappa humana, opcionalmente, donde la secuencia del gen variable de la cadena liviana kappa humana se selecciona de VK1-33, VKI-39, VK3-11, VK3-15, y VK3-20, o una secuencia del gen variable de la cadena liviana lambda humana, opcionalmente, donde la secuencia del gen variable de la cadena liviana lambda humana se selecciona de VL1-44 y VL1-51.

11. El método de la reivindicación 1, donde la pluralidad de las secuencias de ácidos nucleicos de la estructura aceptora comprende una mezcla de al menos una secuencia de ácidos nucleicos de la estructura aceptora de la cadena pesada (VH) variable y al menos una secuencia de ácidos nucleicos de la estructura aceptora de la cadena liviana variable.

12. El método de la reivindicación 1, que además comprende las etapas de (e) clonar la biblioteca de ácidos nucleicos que codifican los dominios variables de la inmunoglobulina de la etapa (d) en un vector de expresión y (f) transformar el vector de expresión de la etapa (e) en una célula huésped y cultivar la célula huésped en condiciones suficientes para expresar una pluralidad de dominio variable de la inmunoglobulina codificado por la biblioteca.

13. El método de la reivindicación 12, donde la célula huésped es E. coli.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 12, donde el vector de expresión es un fagémido o un vector 20 fago.