Polipéptidos de unión al receptor de Fc con funciones efectoras modificadas.

Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une con TLR4 soluble,

el complejo TLR4/MD2, o tanto TLR4 solublecomo el complejo TLR4/MD2, comprendiendo el anticuerpo o fragmento del mismo:

(i) una región variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 de cadena pesada que comprende lasecuencia de aminoácidos GGYSWH (SEC ID Nº: 23), una región CDR2 de cadena pesada que comprende lasecuencia de aminoácidos YIHYSGYTDFNPSLKT (SEC ID Nº: 24), y una región CDR3 de cadena pesada quecomprende la secuencia de aminoácidos de KDPSDAFPY (SEC ID Nº: 80);

(ii) una región variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 de cadena ligera que comprende lasecuencia de aminoácidos RASQSISDHLH (SEC ID Nº: 28), una región CDR2 de cadena ligera que comprendela secuencia de aminoácidos YASHAIS (SEC ID Nº:29), y una región CDR3 de cadena ligera que comprende lasecuencia de aminoácidos de QQGHSFPLT (SEC ID Nº: 83); y

(iii) al menos una parte de unión a FcγR de una región Fc,

en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además al menos dos mutaciones en comparación con unpolipéptido de partida y en el que una mutación es una sustitución con serina en la posición de aminoácido EU 325,y una mutación es una sustitución con fenilalanina en la posición de aminoácido EU 328.

Polipéptidos de unión al receptor de Fc con funciones efectoras modificadas Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos que incluyen una región Fc variante en los que dicha región Fc variante incluye al menos una modificación de aminoácidos en relación con una región Fc natural, cuando la región Fc variante tiene características de unión modificadas para el receptor Fc gamma humano IIA (CD32A) que conducen a la prevención de liberación de mediadores proinflamatorios (por ejemplo, TNF-alfa , Interleucina (IL) -1, IL-6, IL-8 y quimiocinas) , y una región CDR3 variante, en los que la región CDR3 variante incluye al menos un aminoácido modificado en relación con una región CDR3 natural.

Antecedentes de la invención Los anticuerpos, o inmunoglobulinas, comprenden dos cadenas pesadas unidas entre sí por enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras, estando cada cadena ligera unida a una cadena pesada respectiva por enlaces disulfuro. La estructura general de un anticuerpo de clase IgG (es decir, una inmunoglobulina (Ig) de clase gamma (G) se muestra de forma esquemática en la Figura 1 A.

Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en su otro extremo, estando el dominio variable de cadena ligera alineado con el dominio variable de la cadena pesada y estando el dominio constante de cadena ligera alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada.

El antígeno se une a los anticuerpos mediante un sitio de unión a antígeno en los dominios variables de cada par de cadenas ligera y pesada. Otras moléculas, conocidas como moléculas efectoras, se unen a otros sitios en el resto de la molécula, es decir, distintos de los sitios de unión a antígeno, y esta parte del anticuerpo se denominará “la parte constante” de un anticuerpo, estando dichos sitios localizados particularmente en la región Fc constituida por las partes de las cadenas pesadas que se extienden más allá de los extremos de las cadenas ligeras.

La parte constante de los anticuerpos interacciona específicamente con receptores en células “efectoras”. Por ejemplo, la región Fc media en las funciones efectoras que se han dividido en dos categorías. En la primera están las funciones que aparecen independientemente de la unión de antígenos; estas funciones debido al receptor relacionado con el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I FcRn confieren persistencia de IgG en la circulación y la capacidad de transferirse entre barreras celulares por transcitosis (véase Ghetie V y Ward S) . En la segunda están las funciones que actúan después de que un anticuerpo se una a un antígeno; estas funciones implican la participación de la cascada de complementos o células que portan receptor de Fc (FcR) .

Los FcR se definen por su especificidad por isotipos de inmunoglobulina. Por ejemplo los receptores de Fc para anticuerpos IgG se denominan Fc!R. Los FcR son receptores de superficie celular especializados en células hematopoyéticas que median tanto la retirada de patógenos recubiertos con anticuerpo por fagocitosis de complejos inmunitarios, como la lisis de eritrocitos y otras diversas dianas celulares (por ejemplo, células tumorales) recubiertas con el anticuerpo correspondiente.

Los Fc!R desempeñan un papel crítico en la anulación o potenciación del reclutamiento inmunitario. En la actualidad, se distinguen tres clases de Fc!R en células del sistema inmunitario: el receptor de alta afinidad Fc RI (CD64) , capaz de unirse a IgG monomérico; y los receptores de baja afinidad Fc!RII (CD32) y Fc!RIII (CD16) , que interaccionan preferentemente con IgG en complejo. Además, las clases Fc!RII y Fc!RIII comprenden formas tanto “A” como “B” (Gessner -JE et al Ann Heamatol, 1998, The IgG Fc receptor family, 76: 231-248) .

Las proteínas Fc!RII son glicoproteínas integrales de membrana de 40 kDa que se unen solamente al IgG en complejo debido a una baja afinidad por Ig monomérico (106 M-1) . Este receptor es el Fc!R más ampliamente expresado, presente en todas las células hematopoyéticas, incluyendo monocitos, macrófagos, linfocitos B, linfocitos NK, neutrófilos, mastocitos y plaquetas. Fc!RII tiene solamente dos regiones de tipo inmunoglobulina en su cadena de unión a inmunoglobulina y por lo tanto una afinidad mucho menor por IgG que Fc!RI. Hay tres genes de Fc!RII humanos (Fc!RII-A, Fc!RII-B, Fc!RII-C) , todos los cuales se unen a IgG en agregados o complejos inmunitarios. El gen para el receptor de Fc!RII contiene G o A en el codón 131, que da como resultado arginina (CGT) o histidina (CAT) , respectivamente, en el segundo dominio extracelular. Este cambio altera la capacidad del receptor para unirse a IgG. Las células con Fc!RIIA His-131, el genotipo A/A, se unen a IgG2 con afinidad considerablemente mayor que las de Arg en la posición 131; por el contrario, las células con Arg-131, el genotipo G/G, se unen a IgG1 murino con afinidad considerablemente mayor que las de His en la posición 131 (Salmon et al., 1992, J. Clin. Invest. 89:1274-1281) . Originalmente, los estudios que usaban interacción de monocitos con un anticuerpo anti-CD3 de la subclase IgG1 murina como un desencadenante de proliferación de linfocitos T clasificaban a los individuos fenotípicamente como de respuesta baja o de respuesta alta (Tax et al., 1983, Nature: 304: 445-447) . Se sabe ahora que las células de respuesta alta en este ensayo tienen el genotipo G/G o A/G mientras que las células de respuesta baja tienen el genotipo A/A. El genotipo Fc!RIIa 131 R/R es un factor de riesgo para la susceptibilidad a algunas

enfermedades infecciosas y autoinmunitarias (Van der Pol W.L. y Van de Winkel J.G.J., 1998, Immunogenetics 48: 222-232) .

Las diferencias características dentro de los dominios citoplasmáticos de Fc!RII-A y Fc!RII-B crean dos respuestas funcionalmente heterogéneas a la ligación de receptor. La diferencia fundamental es que la isoforma A inicia la señalización intracelular que conduce a activación celular tal como fagocitosis y estallido respiratorio, mientras que la isoforma B inicia la señal inhibidora, por ejemplo, que inhibe la activación de linfocitos B.

Se han usado ahora anticuerpos monoclonales (mAb) para tratar enfermedades en pacientes humanos. Aunque algunos mAb pueden actuar eficazmente sin utilizar funciones efectoras de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos neutralizadores) , en muchos casos puede ser deseable modificar por ingeniería genética la parte Fc del anticuerpo para reclutar el sistema inmunitario para inducir una respuesta inmunitaria. Existe la necesidad en la técnica de producir anticuerpos que incluyan una región Fc variante que tenga potencia aumentada conservando la capacidad para unirse a una diana dada. En consecuencia, existe la necesidad de producir anticuerpos IgG alterados que induzcan una actividad de receptor de Fc modificada conservando a la vez la unión con un antígeno en comparación con un anticuerpo inalterado.

El documento WO2006/085967 describe anticuerpos que se unen a CD20 y tienen una región de unión a receptor Fc gamma modificada.

El documento US2006/0134709 describe anticuerpos que se unen a un antígeno de cáncer y tienen una región Fc modificada.

El documento US6.528.624 describe anticuerpos que se unen a un ligando o receptor y tienen una región Fc modificada.

Los documentos WO2006/077471 y WO2005/065015 describen anticuerpos que se unen al complejo TLR4/MD-2.

Compendio de la invención y divulgación De acuerdo con la invención se proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a TLR4 soluble, el complejo TLR4/MD2 o tanto TLR4 soluble como el complejo TLR4/MD2, comprendiendo el anticuerpo o fragmento del mismo:

(i) una región variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GGYSWH (SEC ID Nº: 23) , una región CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos YIHYSGYTDFNPSLKT (SEC ID Nº: 24) y una región CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de KDPSDAFPY (SEC ID Nº: 80) ;

(ii) una región de cadena ligera variable que comprende una región CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSISDHLH (SEC ID Nº: 28) , una región CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos YASHAIS (SEC ID Nº: 29) y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de QQGHSFPLT (SEC ID Nº: 83) ; y

(iii) al menos una parte de unión a Fc!R de una región Fc,

en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une con TLR4 soluble, el complejo TLR4/MD2, o tanto TLR4 soluble como el complejo TLR4/MD2, comprendiendo el anticuerpo o fragmento del mismo:

(i) una región variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GGYSWH (SEC ID Nº: 23) , una región CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos YIHYSGYTDFNPSLKT (SEC ID Nº: 24) , y una región CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de KDPSDAFPY (SEC ID Nº: 80) ;

(ii) una región variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSISDHLH (SEC ID Nº: 28) , una región CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos YASHAIS (SEC ID Nº:29) , y una región CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de QQGHSFPLT (SEC ID Nº: 83) ; y

(iii) al menos una parte de unión a Fc!R de una región Fc,

en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además al menos dos mutaciones en comparación con un polipéptido de partida y en el que una mutación es una sustitución con serina en la posición de aminoácido EU 325, 15 y una mutación es una sustitución con fenilalanina en la posición de aminoácido EU 328.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo induce una actividad del receptor Fc gamma modificado.

3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en el que

a) la actividad del receptor Fc gamma modificado es la inhibición de la liberación de mediadores proinflamatorios, 20 o b) dicho receptor Fc gamma es el CD32A humano.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es isotipo IgG1 humano, isotipo IgG2 humano, isotipo IgG3 humano o isotipo IgG4 humano.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la región variable de cadena pesada

comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 66 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 73.

6. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en la activación de la señalización de ICAM.

7. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en el 30 tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o trastorno inflamatorio.