Anticuerpos anti-RANTES y métodos de uso de los mismos.

Anticuerpo anti-RANTES humana monoclonal completamente humano aislado o fragmento del mismo,

en el que dicho anticuerpo comprende:

a) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, o

b) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o

c) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; y una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36;

en el que dicho anticuerpo se une a RANTES.

Anticuerpos anti-RANTES y métodos de uso de los mismos

Campo de la invención Esta invención se refiere en general a anticuerpos monoclonales completamente humanos que se unen a RANTES (regulada tras activación, expresada y secretada por células T normales) así como a métodos para el uso de los mismos.

Antecedentes de la invención RANTES (regulada tras activación, expresada y secretada por células T normales, CCL5) es una quimiocina que es un quimioatrayente para eosinófilos, monocitos y linfocitos.

Bums et al. (Journal of Experimental Medicine vol. 188 (1998) , págs. 1917-1927) se refiere a un anticuerpo monoclonal (Acm 4A12) que se une a RANTES humana, bloquea su actividad antiviral e inhibe la movilización de calcio intracelular provocada por RANTES.

Se han implicado niveles elevados de expresión de RANTES en una variedad de enfermedades y trastornos. Por consiguiente, existe una necesidad de terapias que seleccionen como diana la actividad de RANTES.

Sumario de la invención La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos monoclonales completamente humanos, que se unen específicamente a regulada tras activación, expresada y secretada por células T normales (RANTES, también denominada en el presente documento CCL5) y que comprenden las secuencias de CDR de regiones variables SEQ ID NO 8, 9, 20, 14, 15 y 16; o SEQ ID NO 8, 9, 10, 14, 15 y 16; o SEQ ID NO 28, 29, 30, 34, 35 y 36. Los anticuerpos monoclonales según la invención incluyen los anticuerpos a los que se hace referencia en el presente documento como 1D9, 1E4 y C8. Los anticuerpos se denominan respectivamente en el presente documento anticuerpos frente a huRANTES. Los anticuerpos frente a huRANTES incluyen anticuerpos monoclonales completamente humanos, así como anticuerpos monoclonales humanizados y anticuerpos quiméricos.

Preferiblemente, los anticuerpos frente a huRANTES tienen un formato de isotipo IgG1. Más preferiblemente, los anticuerpos frente a huRANTES tienen un formato de isotipo IgG1.

Anticuerpos con formato de IgG1 a modo de ejemplo proporcionados por la presente invención son los anticuerpos 1D9, 1E4 y C8 con formato de IgG1 que comprenden la secuencia de cadena pesada y la secuencia de cadena ligera mostradas a continuación, y las secuencias de CDR se muestran en recuadros:

> Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 1D9 (SEQ ID NO: 263)

> Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 1D9 (SEQ ID NO: 264)

> Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 1E4 (SEQ ID NO: 238)

> Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 1E4 (SEQ ID NO: 254)

> Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de C8 (SEQ ID NO: 186)

> Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de C8 (SEQ ID NO: 187)

La línea germinal más cercana para los anticuerpos frente a huRANTES descritos en el presente documento se muestra a continuación en la tabla 1:

Tabla 1. Líneas germinales más cercanas para los anticuerpos frente a huRANTES. Los anticuerpos marcados en 20 cursiva se derivaron mediante un proceso de maduración por afinidad a partir del anticuerpo 2D1 (parte inferior de la tabla) .

ID de clon Número dp de VH Número dp de VL

C8 Vh3_DP-46_ (3-30.3) Vlambda3_3h

1D9 Vh1_DP-5_ (1-24) Vlambda3_3h

1E4 Vh1_DP-5_ (1-24) Vlambda3_3h

La invención también proporciona anticuerpos que se unen a RANTES humana cuando RANTES humana está

unida a glucosaminoglucano (GAG) , es decir, se unen a RANTES humana en el contexto de GAG. En una realización preferida, estos anticuerpos incluyen (a) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (b) una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (c) una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ó 20, (d) una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (e) una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y (f) una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; o anticuerpos que incluyen (a) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 28; (b) una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 29; (c) una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 30; (d) una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 34; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 35; y (f) una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 36.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un isotipo IgG, tal como, por ejemplo, un isotipo IgG1.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos de tratamiento, prevención o alivio de un síntoma de un trastorno relacionado con la inmunidad administrando un anticuerpo frente a huRANTES según la invención a un sujeto. Por ejemplo, los anticuerpos frente a huRANTES se usan para tratar, prevenir o aliviar un síntoma asociado con una enfermedad autoinmunitaria o un trastorno inflamatorio. Opcionalmente, al sujeto se le administra adicionalmente un segundo agente tal como, pero sin limitarse a, un reactivo anti-citocinas, reactivo anti-quimiocinas, un reactivo anticitocinas o un agente anti-receptor de quimiocinas que reconoce el ligando o receptor para proteínas tales como interleucina 1 (IL-1) , IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, MIP1 alfa, MIP1 beta, IP-10, MCP1, ITAC, MIG, SDF y fractalquina.

El sujeto está padeciendo o está predispuesto a desarrollar un trastorno relacionado con la inmunidad, tal como, por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria o un trastorno inflamatorio. Preferiblemente, el sujeto es un mamífero, y más preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 es una serie de gráficos que representan la actividad de anticuerpos anti-huRANTES en ensayos de quimiotaxis usando células L1.2 transfectadas con hCCR5 y 1 nM o 0, 2 nM de RANTES humana recombinante (figura 1A y B respectivamente) así como RANTES humana nativa (figuras 1C) .

La figura 2 es un gráfico que representa la capacidad de anticuerpos anti-huRANTES para unirse a huRANTES en el contexto de glucosaminoglucanos y en un ensayo ELISA.

La figura 3 es una serie de gráficos que representan la actividad del anticuerpo anti-huRANTES 1E4 en ensayos de flujo de calcio usando: células L1.2 que expresan hCCR1 y RANTES humana recombinante 25 nM (figura 3A) ; células L1.2 que expresan hCCR3 y RANTES humana recombinante 25 nM (figura 3B) ; células L1.2 que expresan hCCR5 y RANTES humana recombinante 4 nM (figura 3C) .

La figura 4 es una serie de gráficos que representan la actividad del anticuerpo anti-huRANTES 1E4 en ensayos de quimiotaxis usando: células L1.2 que expresan hCCR1 y 2 nM de RANTES humana recombinante (figura 4A) ; células L1.2 que expresan hCCR3 y 10 nM de RANTES humana recombinante (figura 4B) ; células L1.2 que expresan hCCR5 y 1 nM de RANTES humana recombinante (figura 4C) ; células L1.2 que expresan hCCR5 y aproximadamente 1 nM de RANTES humana nativa (figura 4D) .

La figura 5 es un gráfico que representa el perfil de reactividad cruzada de anticuerpo 1E4 contra un panel de quimiocinas de ser humano, mono cynomolgus, ratón y rata en un ELISA.

La figura 6 es una alineación de secuencias de proteína RANTES madura de ser humano (SEQ ID NO: 170) , mono cynomolgus (SEQ ID NO: 171) , ratón (SEQ ID NO: 172) y rata (SEQ ID NO: 206) . Las flechas indican las posiciones que están conservadas en RANTES de ser humano y mono cynomolgus pero no en las secuencias de ratón o rata y que se seleccionaron como diana mediante mutagénesis dirigida al sitio.

La figura 7 es un gráfico que representa la unión de anticuerpo 1E4 (barras blancas) o de un anticuerpo policlonal generado contra RANTES de ratón (barras con trama diagonal) a RANTES humana, RANTES de ratón y variantes de RANTES de ratón en las que los aminoácidos de ratón indicados se han reemplazado por los aminoácidos encontrados en la secuencia humana en la misma posición.

La figura 8 es una ilustración que representa el protocolo de un modelo de isquemia-reperfusión murino proporcionado en el presente documento.

La figura 9 es una serie de gráficos que representan que el tratamiento con anticuerpo anti-RANTES disminuyó el tamaño del infarto en un modelo murino... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo anti-RANTES humana monoclonal completamente humano aislado o fragmento del mismo, en el que dicho anticuerpo comprende:

a) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, o b) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o c) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; y una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36;

en el que dicho anticuerpo se une a RANTES.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que a) dicho anticuerpo es un isotipo IgG o b) dicho anticuerpo es un isotipo IgG1.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, y en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, y en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

5. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; y una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, y en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

6. Anticuerpo según la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 238 y una secuencia de cadena ligera

que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 254.

7. Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 263 y una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 264.

8. Anticuerpo según la reivindicación 5, en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 186 y una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187.

9. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo se une a RANTES humana cuando RANTES humana está unida a un glucosaminoglucano (GAG) .

10. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el fragmento se selecciona de Fv, Fab, Fab’, F (ab’) 2, scFv, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos biespecíficos y anticuerpos heteroconjugados.

11. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador.

12. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en un método de tratamiento para aliviar un síntoma de una enfermedad autoinmunitaria o un trastorno inflamatorio, comprendiendo dicho método administrar el anticuerpo a un sujeto que lo necesita en una cantidad suficiente para aliviar el síntoma de la enfermedad autoinmunitaria o el trastorno inflamatorio en el sujeto.

13. Anticuerpo según la reivindicación 9, en el que dicho sujeto es un ser humano.